链格孢属真菌及我国蔬菜链格叶斑病的研究进展
综述关键词：
链格孢属，叶斑病，研究进展 文献综述摘要：
链格孢属（Alternaria）真菌形态特征醒目，很容易辨认到属。但是一些小孢子种的形态特征相似，导致链格孢属真菌种级分类鉴定困难重重。目前，对链格孢属真菌的形态学分类系统已较为完善，但形态学分类存在固有的缺点，难以克服。随着真菌分类与鉴定技术的不断进步，分子生物学分类法和生理生化方法逐渐应用于植物病原真菌的鉴定（Guillemette, 2004; Hong, 2006），使我们有机会去重新量化的认识以前建立在形态学基础上的知识体系。我国蔬菜链格叶斑病发生普遍，病原菌寄主范围广泛，特别是在茄科、葫芦科、十字花科、百合科的蔬菜上危害尤为严重。蔬菜上链格叶斑病曾多次在世界各地爆发，严重影响了我国蔬菜的产量与质量。 文献综述：
1 链格孢属真菌研究进展
链格孢属Alternaria 和相似属Stemphylium，Ulocladium，Nimbya，Embellisia，Gibbago 等的区别为在产孢表型，分生孢子梗的延伸，产孢细胞及分生孢子的特点等方面相似性很大，特别是Alternaria，Stemphylium，Ulocladium 三属，长期以来争议最大。自从 Simmons(1967)发表了文章“Typification of Alternaria，Stemphylium and Ulocladium”才使三属的属级概念基本明确。Stemphylium 从分生孢子梗的特征上可以和 Alternaria 和 Ulocladium 区分，Stemphylium 分生孢子梗以层出方式作环痕式 (ann) 延伸，梗顶端膨大，有一孢痕，产生单个末端分生孢子，孢子长椭圆形、布袋形，中部隔膜隘缩。
Alternaria 和 Ulocladium 有相似的产孢梗，均为内壁芽生孔生式产孢，作合轴式延伸。二属的主要区别在于未成熟孢子的基部特征。Alternaria 的分生孢子在产孢梗上初形成时与产孢梗接触点粗大向尖端渐细，分生孢子倒棍棒状或卵圆形，多数具喙，而Ulocladium 的分生孢子在产孢梗上初形成时，基部尖细，随着孢子的成熟基部会变得钝圆。另外 Alternaria 的喙 (特别是小孢子种) 易作为次生分生孢子梗继续产生孢子，形成长链，而 Ulocladium 的分生孢子具喙或不具喙，即使成链，也是形成很短的链。 1.1 链格孢属真菌形态学分类研究进展
链格孢属（Alternaria）自建属以来经历了近两百年的研究历史。自上世纪60年代以来，国内外学者对链格孢的研究明显增多，先后提出了链格孢属的种级分类标准。目前，关于链格孢形态学较为系统全面的专著有Simmons编著的链格孢鉴定手册《Alternaria》和张天宇编著的《中国真菌志》第十六卷链格孢属。《中国真菌志》主要根据病原菌的寄主种类，以观察自然标本上病原菌形态为主，描述了链格孢119个种（张天宇, 2003）。《Alternaria》在常规形态学鉴定的基础上，根据链格孢属真菌的三维产孢结果特征，描述了276种链格孢种（Simmons, 2007）。目前，链格孢属真菌的形态学分类，主要参照菌丝、菌落、分生孢子梗、分生孢子、喙的特征以及寄主等信息进行分类和鉴定（Neergaard,1945; 张天宇,2002; Emory G.Simmons, 2007）。具体参照以下标准：①菌丝特征，用于区分菌丝能产生特殊结构的链格孢种如A.japonica；②菌落形态，只用于区分个别种；③分生孢子梗形态，其长短、直径、单生或簇生、分枝或不分枝、产孢方式、延伸方式都是种级鉴定特征；④分生孢子，是种级分类的主要依据，种级分类依据分生孢子性状（倒棍棒形，卵形或倒梨形）、大小、分隔（横隔膜、纵斜隔膜数）、颜色、孢子表面纹饰、产孢表型（孢子单生或链生，形成短链或长链，链分枝或不分枝）；⑤喙，是一类明显而有用的种级分类标准；⑥寄主（自然标本）。
链格孢属真菌种下分类（变种、转化型、生理小种）研究较少，未形成完善的分类系统和分类标准。《中国真菌志》中描述了3个变种和2个专化型，目前已见报道的链格孢（Alternaria）种下描述较少。
链格孢属形态学鉴定容易区分大孢子链格孢种如茄链格孢（A.solani）、芸薹链格孢（A.braicae）和芸薹生链格孢（A.braicicola）等，但很难区分小孢子链格孢种。国内外研究者也发现同一菌株在不同的培养基或温度下，其产孢结构和分生孢子形态会受到一定程度的影响，菌株特性也会随着时间推移而变化，这些因素都影响着病原菌的形态特征（Leahy et al., 2010; Andersen et al., 2008）。因此，为了更加准确的对链格孢属真菌进行分类与鉴定，国内外学者不断探索新的分类技术与鉴定方法，如生物化学方法和分子生物学方法等。 1.2 链格孢属真菌生物化学方法分类研究进展
链格孢菌能产生有毒次生代谢产物，数量多达70多种，在谷物、花生、果酱和新鲜蔬菜水果上产生的代谢物已备受社会关注（Bottalico et al., 1998; Andersen, 2015）。早期，研究者主要集中于探索链格孢毒素与经济作物及农作物的关系，以指导防治（Logrieco et al., 2009）。近年来，链格孢毒素在链格孢分类上日渐显示出重要作用。研究者发现，根据链格孢属真菌的次级代谢产物，不仅可以区分链格孢属，更能有效区分链格孢相似种，少数情况下还能区分不同的菌株（Andersen et al., 1996; 2005, 2008, 2009）。因此，链格孢毒素被认为是可用于链格孢分类的有价值的标准之一（孙霞, 2006; Akimitsu et al., 2003）。 此外，可溶性蛋白凝胶电泳分析技术在链格孢种级水平的分类鉴定中具有重要作用，但能否对种以下分类单位进行鉴定分类尚存在争议。蛋白的表达具有组织特异性和发育阶段性，因此须严格控制检测相关条件的一致性，才能保证实验结果的可靠性（孙霞, 2006）。
1.3 链格孢属真菌分子生物学分类研究进展
随着分子生物学的不断进步，研究者已将分子生物学方法逐步应用于链格孢分类鉴定研究中，目前常用方法有序列分析法、系统发育树分析法、分子标记技术等。
1.3.1序列分析法
序列分析法，即对病原菌某一目标基因进行扩增，然后与基因库已有序列进行比对，进而对病原菌进行鉴定。与其他分子生物学方法相比，序列分析法是较为方便快捷的病原菌鉴定方法。在链格孢的分类与鉴定研究中，常用到的目标序列为核糖体RNA序列（ITS）、抗原相关蛋白基因（Alt a 1）、内聚半乳糖醛酸酶基因（endoPG）、线粒体小亚基（mtLSU）、β-微管蛋白（beta-tubulin）、磷酸脱氢酶（gpd）、翻译延长因子（EF-1α）、钙调蛋白基因（CAL）、肌动蛋白基因ACT等基因（Hong et al., 2004）。但是研究者也发现ITS、mtLSU、beta-tubulin、EF-1α、和CHS（岳海梅, 2007; Guillemette et al., 2004）等核苷酸序列很难区分小孢子链格孢，如侵染链格孢（A.infectoria）、苹果链格孢（A.mali）、梨黑斑链格孢（A.gaisen），这些序列在小孢子链格孢中差异极小。与这些基因序列相比，抗原相关蛋白基因（Alt a 1）在链格孢属真菌中差异性较大，已逐渐被研究者用于链格孢的分子鉴定及分类研究中（Pryor et al., 2002）。
ITS序列是核糖体上的转录间隔区，进化过程中所承受的选择压力较小，故常被用于真菌的分类研究。一直以来，研究者努力将ITS序列分析用于链格孢的鉴定和分类研究中（Pavón et al.2012），但大量研究表明ITS序列在小孢子链格孢中差异较小（严进, 2009; 王洪凯, 2001），只能用于区别链格孢与其他属真菌，或用于大孢子链格孢的鉴定和分类。虽然在链格孢的分类研究中，已逐渐放弃通过ITS序列分析进行分类，但是在链格孢的鉴定中，很多学者依然采取形态学与ITS序列分析相结合的方法进行鉴定（Pryor et al., 2000; Bashir et al., 2014; Mckay et al., 1999; 刘芳, 2010; 赵国柱, 2006; 傅本重, 2012; 文朝慧, 2007）。链格孢(特别是小孢子种)r DNA ITS 区的进化未达到判定种间差异的程度，不能作为链格孢种级分类的有效手段。
抗原相关蛋白基因（Alt a 1）为链格孢属真菌产生，与人类哮喘病相关。近几年，研究者发现抗原相关蛋白基因可用于链格孢分类研究，该序列对小孢子种的分类研究意义重大（Lourenço et al., 2009）。Alt a 1基因在链格孢不同种内基因差异较大，对该序列进行分析比较，可以准确快速的鉴定和分区A.alternata, A.radicina, A.porri and A.infectori等小孢子种（Hong et al.2005）。
内聚半乳糖醛酸酶（endoPG）是果胶酶的一种，是分解植物细胞壁的关键酶。果胶酶基因在植物病原真菌高度保守，适合用于真菌的鉴定研究。研究者尝试将endoPG基因用于链格孢属真菌的分类与鉴定中。研究发现，链格孢中一些小孢子种的endoPG基因核苷酸序列差异明显，有的在氨基酸水平也能表现出差异，这些差异可以作为一些小孢子种如梨黑斑链格孢（A.gaisen）和长柄链格孢（A.longipes）的区分。
随着链格孢研究的不断深入，研究者逐步发现更多基因序列，进而更加准确系统的对链格孢属真菌进行分类和鉴定（Peever et al., 2004）。 1.3.2系统发育树分析
系统发育树分析是对物种间相同DNA序列的差异研究，常用于链格孢属真菌系统发育分析的DNA序列有ITS序列、β-微管蛋白、翻译延长因子和抗原相关蛋白基因。与单纯的序列分析相比，根据单个基因构建系统发育树，在一定程度上可对链格孢属真菌进行更加准确的分类。例如基于endoPG基因构建的系统发育树可以将细极链格孢（A.tenuiima）和树状链格孢（A.arborescens）分在不同的两个分支，有效区分了两个小孢子链格孢（Ntasiou et al., 2015）。
单个基因序列与真实DNA存在差别，不能绝对真实的反应样本之间的遗传差别。为了更真实的反应遗传差别，研究者使用多个基因序列联合构建系统发育树，为链格孢的分类研究提供更加准确全面的方法。近年来，系统发育树研究可分出几个链格孢属类群（Chou & Wu, 2002; Hong et al., 2004; Woudenberg et al., 2013），各类群内部还可以继续分支。（1）链格孢类群（A.alternata species-group），包括一些相似的种如链格孢（A.alternata）、柑橘链格孢（A.citri）、细极链格孢（A.tenuiima）、树状链格孢（A.arborescens）和长柄链格孢（A.longipes）。这些种可产生相似的毒素，如格链孢酚（AOH）、交链孢霉甲基醚（AME）、链孢菌酮酸（TeA）（Andersen et al., 2005）。（2）葱链格孢类群（A.porri species-group），包括一些相似种，如茄链格孢（A.solani）、葱链格孢（A.porri）、胡萝卜链格孢（A.dauci）和喜茄链格孢（A.tomatophila），这些菌可以引起胡萝卜、葱、番茄和马铃薯的早疫病（Andersen et al.,2009）。（3）根链格孢类群（A.radicina species-group），这一类群是一种重要的胡萝卜种传病原菌，可产生一系列植物复合毒素（Konstantinova et al., 2002; Pavón et al., 2010）。（4）侵染链格孢类群（A.infectoria species-group），这些菌主要危害生长期及储藏期的谷类作物，可产生区别于其他链格孢种的毒素（Andersen et al., 2009; Pavón, 2010）。 1.3.3常用分子标记技术 （1）限制性片段长度多态性分析（RFLP），该技术已被广泛应用于生物自然居群的遗传变异研究。国内外学者已证实RFLP技术可以在一定程度上检测链格孢种间多态性，还可以检测种内多态性（Konstantinova et al., 2002），但在一些相似种中差异性很小。RFLP分析可以将日本梨链格孢（A.gaisen）分为至少8个变异群体，并证实这些变异群体与地理分布有很大相关性，但是无法区分A.mali、A.gaisen、A.longipes、A.citri等相似菌株（Dini-Andreote et al., 2009）。
（2）随机扩增多态性DNA分析（RAPD）。RAPD技术已被广泛应用于真菌的系统学研究。RAPD技术不仅可以对链格孢种间进行差异性分析，也可以分析链格孢种内差异性（Cooke et al., 1998）。研究表明，与RFLP技术相比，RAPD技术虽不能检测种内差异是否与地理来源以及致病性强弱有关系，但可以对链格孢种内，特别是小孢子链格孢间进行区分（Lorenzini & Zapparoli, 2014; Kakvan et al., 2012）。
（3）扩增片段长度多态性分析（AFLP）。该技术是一种适宜于检测群体遗传多样性的分子标记技术（Barret et al., 1998；Zhu et al., 1998; Dini-Andreote et al., 2009）。AFLP技术是RAPD和RFLP相融合的一种技术，它比RFLP简单安全，比RAPD更稳定，同时还具备了RFLP的稳定可靠性和RAPD的灵活性（Somma et al.2011, Lourenco et al., 2010）等特点。研究者用AFLP技术可以检测出细极链格孢（A.tenuiima）的种内差异（Gannibal et al., 2007; Martinez et al., 2004）。
此外常用于链格孢分类的分子标记技术还有简单重复序列（SSR）技术、简单重复序列区间（ISSR）分析技术等（Hong et al., 2006）。
2 我国蔬菜链格叶斑病的研究进展
我国蔬菜链格叶斑病发生普遍，病原菌寄主范围广泛，特别是在茄科、葫芦科、十字花科、百合科的蔬菜上危害尤为严重。蔬菜上链格叶斑病曾多次在世界各地爆发，严重影响了我国蔬菜的产量与质量。 2.1 茄科蔬菜链格叶斑病发生概况
茄科蔬菜有番茄、茄子、辣椒、马铃薯等，还有许多种类有药用价值，如枸杞和颠茄等。链格孢属真菌引起的茄科番茄早疫病、茄子链格叶斑病、辣椒链格叶斑病以及马铃薯早疫病等在世界各地危害严重。
链格孢属真菌在茄科蔬菜上所造成得病害中，造成损失最大的病害为番茄早疫病与马铃薯早疫病。番茄早疫病早在19世纪80年代初期，已在希腊克里特岛开始发生。马铃薯早疫病于19世纪90年代初期在美国的佛蒙特州首次发现（Kumar et al., 2008）。目前，这两种病害已在澳大利亚、墨西哥、美国、巴拿马、波兰、德国、委内瑞拉、加拿大、巴基斯坦等50多个国家和地区发生危害，部分地区发病严重，导致产量减产35%-78%。20世纪70年代后期、80年代以来，我国部分地区由于推广抗病毒病而不抗早疫病的番茄品种，导致早疫病的大发生，为害日趋严重。一般年份发病率在10％左右，造成产量损失10％-30％，流行年份发病率可达100％，产量损失可达30％-40％。随着我国北方特别是新疆、内蒙等地加工番茄种植面积不断扩大，番茄早疫病的危害逐年加重，番茄早疫病已成为影响加工番茄产量的重要病害之一，制约着新疆等地加工番茄产业的发展。
2.2 葫芦科链格叶斑病发生概况
葫芦科链格叶斑病，又称叶枯病，上世纪80年代末期，葫芦科链格叶斑病曾在美国流行，造成甜瓜和西葫芦（美洲南瓜）严重减产。美国佛罗里达州所种植的甜瓜和西瓜发病最严重，当地葫芦科其他作物如南瓜和黄瓜等也受到了一定程度的感染（杨克泽, 2009）。随着我国葫芦科作物栽培面积不断扩大、品种增多及更替和栽培模式的变化，葫芦科链格叶斑病有危害加重的趋势。1988年至1993年间，浙江省西瓜主产区，链格叶斑病（叶枯病）连年发生，常年发病田块减产20%-30%，严重的可达50%以上。近年来，新疆、甘肃等地瓜类作物发生严重的链格叶斑病，发病后的植株叶片大面积干枯死亡，严重影响着瓜类生产（杨克泽, 2009）。
2.3 十字花科黑斑病发生概况
十字花科蔬菜黑斑病在世界各地普遍发生，在美国、加拿大、印度、中国台湾发生较重。芸薹链格孢（A.braicae）引起的十字花科黑斑病曾多次在印度、孟加拉国、加拿大等国大流行，造成了严重的损失。在欧洲，油菜（oilseed rape）黑斑病是一种很常见的病害（Brazauskiene et al., 2006; Peever et al., 2002）。另外，由于链格孢属真菌可以侵染种子，造成食用油链格毒素污染，严重影响农产品的市场价值（Guillemette et al.2004）。
20世纪40年代，十字花科黑斑病已普遍分布于中国大陆。我国十字花科黑斑病发生比较严重的地区主要有云南省、贵州省、河北省、北京市、兰州省及吉林省的部分地区。1988年，白菜黑斑病在北京地区流行危害，导致当年北京市秋白菜减产达20%以上（郑建秋, 1994）。20世纪90年代末期以来，十字花科黑斑病逐渐在东北地区开始危害，黑龙江哈尔滨、吉林敦化和内蒙古呼伦贝尔都曾大面积发生十字花科黑斑病，田间发病率高达100%，造成减产20%左右。此外，黑斑病不仅影响十字花科蔬菜的产量和品质，还造成贮藏期腐烂，造成严重损失。 2.4 百合科紫斑病发生概况
百合科紫斑病（purple leaf blotch）在世界范围内普遍发生，温暖湿润的环境利于该病的发生与蔓延。紫斑病曾造成印度大蒜减产60%，洋葱减产59%。在我国，紫斑病是新老种植区的主要病害。近几年，青海乐都和甘肃成县等地相继暴发紫斑病，田间发病率达60-80%，严重地区高达100%，造成损失25%以上（邹燕, 2009）。 参考文献：
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