一．培养基的制备
仪器材料 微波炉、高压灭菌器、玻璃器皿、三角瓶，PH试纸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、氢氧化钠。 操作方法
１． 肉汤培养基制作 ⑴成分
肉浸膏（0.3%牛肉膏） 500ml 蛋白胨 5g 氯化钠 2.5g 磷酸氢二钾 0.5g ⑵准备工作 配制调节PH用的0.1M氢氧化钠和1M氢氧化钠溶液。 ⑶操作
①称取牛肉膏，放入玻璃皿中，另入适量蒸馏水配成0.3%。 ②按比例加入适量蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钾搅拌。 ③搅拌加热至完全溶解。
④PH值调至7.8，煮沸10min，站足水分。
⑤待冷至40～50℃时，过滤。滤液分装于无菌试管内（达试管的1/3）或每管加4-5ml。塞好棉塞。
⑥置高压灭菌器内高压灭菌（121.3℃，20分钟即可） 2．普通琼脂培养基制作
⑴成分 肉汤培养基 500ml 琼脂 8-15g ⑵制法
①先矫正肉汤培养基PH值。
②加入适量琼脂煮沸溶解，矫正PH值至7.4～7.6。 ③灭菌后使杂质沉淀。
④取其上清液灭菌后分装。倒入无菌平皿内凝固即成普通琼脂平板。
二、平板划线接种法 【方法】
1． 在平板底面上用记号笔作好标记，如菌种、班级，姓名、接种日期等，并在平板底面边缘作一原划线标记。
2．右手拿接种环，烧灼灭菌并冷却后，取混合菌液少许。 3．左手斜持（45°角）琼脂平板，略开盖，平板在乙醇灯火焰左前上方约5～6cm距离。右手持已取标本的接种环在琼脂平板表面之一侧边缘，作原划线，见图5-2A。
4．接种环烧灼灭菌，冷却后自原划线末端沾取少许标本，使接种环与平板表面成30～40°角，运用腕力将接种环在平板上来回划线，见图5-2B。划线要密但不能重叠，充分利用平板的表面积，不要划破琼脂表面，并注意无菌技术，避免空气中细菌的污染。 也可用分区划线法，即从原划线末端沾取标本后只划平板的1/5～1/4，划毕烧灼灭菌接种环，冷后同样划线，共计4～5次。接种环烧灼灭菌后方可放下（图5-2C、D、E）。
三.细菌在培养基中生长特性的观察 1.琼脂培养基 ⑴大小
⑵形状：圆形、不整形、针尖状、露滴状、同心圆状、颗粒状。 ⑶边缘：整齐、波浪状、锯齿状、卷发状。
⑷表面性状：光滑、粗糙、同心圆状、放射状、皱状、颗粒状。 ⑸湿润度：湿润、干燥。
⑹隆起度：表面隆起、轻度隆起、中央隆起、扣状扁平。
⑺色泽及透明度：无色、白色、黄色、橙色、红色；透明、半透明、不透明。 ⑻质地：坚硬、柔软、粘稠。
⑼溶血性：α型溶血 菌落周围有透明溶血环。
β型溶血 半透明带绿色溶血环。
γ型溶血 不溶血。
药物敏感试验
基本原理
细菌对抗菌药物的敏感试验，通常简称为细菌的药敏试验。在给患传染病动物进行治疗时，测定细菌对药物的敏感性，不仅有助于选择合适的药物，而且可为药物的用量提供依据。某种细菌对药物的敏感度，是指抑制该细菌生长所需的最低药物浓度。细菌在体外的敏感度和临床的疗效大体是符合的，但也有不一致者。目前供药敏试验的方法很多，可归纳为两大类，即稀释法和扩散法。有的以抑制细菌生长为评定结果的标准，有的则以杀灭细菌为标准。一般可报告为某菌对某抗菌药物敏感、轻度敏感或耐药。
稀释法是将抗菌药物稀释为不同的浓度，作用于被检菌株，定量测定药物对细菌的最低抑菌浓度(minimal inhibition concentration, MIC)或最低杀菌浓度(minimal bacteriocidal concentration, MBC)，可在液体培养基或固体培养基中进行。
扩散法（diffusion method）是将抗菌药物置于已接种待测细菌的固体培养基上（或内），抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感菌的生长，从而出现抑菌环（带）。药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度就越低，故可根据抑菌环的大小，判断细菌对药物的敏感度。抑菌环（带）边缘的药物含量即该药物的敏感度。此法操作简便，容易掌握，但只用于定性。因受纸片含药量不均及接种量等多种因素影响，结果不够准确，因此试验时应同时设立已知敏感度的标准菌株作为对照。
器材准备
1．菌种 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌。
2．药敏试纸 含青霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉素、磺胺嘧啶等药敏试纸，分装于灭菌平皿中。
3．培养基 普通肉汤、普通琼脂平板培养基。
4．其他 95％酒精、小镊子、麦氏比浊管、1mL刻度吸管、橡皮胶头等。
实验步骤
1．试管双倍稀释法
（1）抗生素原液的配制及保存：将抗生素制剂无菌操作溶于适宜的溶剂如蒸馏水、磷酸盐缓冲液中，稀释至所需浓度。抗生素的最初稀释剂通常用蒸馏水，但是有些抗生素必须用其它溶剂作初步溶解。常用抗生素原液的溶剂和最初稀释剂见表6-1。若制剂中可能含有杂菌，配制后宜用细菌滤器过滤除菌（可用玻璃滤器或微孔滤膜，孔径0.22m，但不可用纤维垫滤器）。分装小瓶，在－20℃冷冻状态下保存，可保存3个月或更久，每次取出一瓶保存于4℃冰箱，可用1周左右。
（2）培养基：一般采用普通肉汤培养基。如细菌生长缓慢，可加入0.25％～1％葡萄糖或5％～10％血清。
（3）方法：被测菌种悬液的制备：将较多量的菌种移种于肉汤培养管中，置37℃温箱中培养6h（生长缓慢者可培养过夜），使生长浊度达9×108个/mL（相当于麦氏比浊管第3管）。
抗生素溶液的双倍连续稀释：取13×100mm灭菌带棉塞试管13支（管数多少可依具体需要而定）。另将上述菌液作1︰10 000倍稀释（生长缓慢的细菌可稀释1︰1 000或更少），除第1管加入稀释菌液1.8mL外，其余各管均各加1.0mL。继于第1管加入抗生素原液0.2mL，混合后吸出1.0mL加入第2管中，用同法依次稀释至第12管，弃去1.0mL。第13管为生长对照。
表6-1 抗生素原液的溶剂和稀释剂
抗生素
丁胺卡那霉素 氯苄青霉素 杆菌肽 羧苄青霉素 头孢羟唑 头孢唑林 头孢甲氧霉素 头孢菌素I 氯霉素 氯洁霉素 多粘菌素B或E 红霉素
溶剂 蒸馏水
0.1mol/L PBS（pH值8.0）
蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水
0.1mol/L PBS（pH值8.0）
甲醇 蒸馏水 蒸馏水 甲醇
稀释剂 蒸馏水
0.1mol/L PBS（pH值8.0）
蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水
0.1mol/L PBS（pH值8.0） 庆大霉素 卡那霉素
新青霉素I、II、III 青霉素G 萘啶酸 链霉素 四环素 妥布霉素 万古霉素
蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 0.1mol/L NaOH
蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水
蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水 蒸馏水
培养及结果观察：置37℃培养16～24h，观察结果。凡药物最高稀释管中无细菌生长者，该管的浓度即为MIC。
MBC的测定：从无细菌生长的各管取材，分别划线接种于琼脂平板培养基，于37℃培养过夜（或48h），观察结果。琼脂平板上无细菌生长而含抗生素最少的一管，即为MBC。也可将上述各管在37℃继续培养48h，无细菌生长的最低浓度即相当于该抗生素的MBC。
结果报告：一般以MIC作为细菌对药物的敏感度，如第1～8管无细菌生长，第9管开始有细菌生长，则把第8管抗生素的浓度报告为该菌对这种抗生素的敏感度；如全部试管均有细菌生长，则报告该菌对这种抗生素的敏感度大小为第1管中的浓度或对该药耐药；如除对照管外，全部都不生长时，则报告为细菌对该抗生素的敏感度等于或小于第12管的浓度，或高度敏感。
2．扩散法（K-B法）
（1）含药滤纸片的制备：含有各种抗菌药物的滤纸片是扩散法中应用最多的。目前，我国生产含药滤纸片的单位不多，购买较为困难，即使购买也易过期失效，所以一般可应用自制的药敏滤纸片。其方法如下：
滤纸片：选用新华1号定性滤纸，用打孔机打成直径为6mm的小圆片，根据需要将数片包成一纸包或放入带棉塞的小瓶或小平皿内，121℃灭菌15min，置100℃干燥箱内烘干备用。
药液的配制：常用药物的配制方法及所用浓度见表6-2。
表6-2 药敏纸片的制备及含药浓度
药 物 青霉素 剂 量 注射用粉剂
制备方法
20mg加pH值6.0 PB缓冲液15.5mL，取1mL加PB缓冲液9mL
20mg加pH值6.0 PB缓冲液20mL 20mg加pH值7.8 PB缓冲液 8mL 以pH值7.8 PB缓冲液作100倍稀释 以pH值6.0 PB缓冲液稀释 20mg加水20mL溶解
药液浓度 （g/mL）
200 1 000 2 500 2 500 1 000 1 000
纸片含量 （g）
20 10 25 25 10 10 新青霉素 注射用粉剂
注射用粉剂
链霉素
注射用针剂 注射用针剂
氯霉素
口服粉剂 土霉素 口服粉剂或片剂
25mg粉末，加2.5mol/L HCl 15mL 溶解后，以pH值6.0 PB缓冲液或水稀释
1 000 1 000 1 000 1 000 1 000 1 000 1 500 3 000 3 000 1 000 3 000 1 000 1 000 1 000 1 000 10 000 10 000 1 000 10 000 10 000 10 000 125
10 10 10 10 10 10 10 30 30 10 300 10 10 10 10 100 100 100 100 100 100 1.25 四环素 口服粉(片)
同土霉素
剂
注射用粉剂 口服片剂
以生理盐水稀释 同土霉素
以pH值3.0 PB缓冲液溶解后以pH值6.0 PB缓冲液稀释
以pH值8.2 PB缓冲液溶解后稀释 以水溶解，以pH值7.8 PB缓冲液稀释 同红霉素
以pH值7.8 PB缓冲液稀释 以pH值7.8 PB缓冲液稀释 以pH值7.2 PB缓冲液稀释 以pH值7.8 PB缓冲液稀释
以1mol/L NaOH 1mL溶解1片，用pH6.0 PB缓冲液稀释 以1mol/L NaOH 1mL溶解1片，用pH6.0 PB缓冲液稀释
以二甲基酰胺或丙酮溶解 以水稀释
以水或pH值8.2 PB缓冲液稀释 100mg加2.5mol/L HCl 1.25mL，加水至5mL，以pH值6.0 PB缓冲液稀释 100mg加水1mL，浓HCl 0.7mL溶解，以pH8.2 PB缓冲液稀释
100mg加水2mL，浓HCl 0.5mL溶解，以pH8.2 PB缓冲液稀释
100mg加浓HCl 1mL，溶解后以pH6.0 PB缓冲液稀释
1片研碎后加水2mL，浓HCl 0.25mL， 以pH值6.0及7.8 PB缓冲液稀释 金霉素
口服粉剂
新霉素 红霉素 口服片剂 注射用粉剂 注射用粉剂
卡那霉素
注射用针剂
庆大霉素 注射用针剂 多粘菌素 注射用粉剂 万古霉素 注射用粉剂 呋喃妥因 粉剂或片剂 呋喃西林 粉剂或片剂 痢特灵 磺胺嘧啶片剂
粉剂或针剂
钠
磺胺二甲基针剂
嘧啶
长效磺胺 片剂 周效磺胺 片剂 磺胺甲基异恶唑
磺胺5-甲氧嘧啶
磺胺增效剂
片剂 片剂 片剂
含药纸片的制备：将灭菌滤纸片用无菌镊子摊布于灭菌平皿中，以每张滤纸片饱和吸水量为0.01mL计，每50张滤纸片加入药液0.5mL，不时翻动滤纸片，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30min即可。然后取出含药纸片置于一纱布袋中，以真空抽气使之干燥。或直接将滤纸片摊于37℃温箱中烘干，烘烤的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。对青霉素、金霉素等纸片的干燥宜用低温真空干燥法。干燥后，立即装入无菌的小瓶中加塞，置于干燥器内保存，也可将纸片贮藏于－20℃或家用冰箱冰冻。少量供工作用的纸片从冰箱中取出后应在室温中放置1h，使纸片温度和室温平行，防止冷的纸片遇热产生凝结水。
药敏纸片的鉴定：取制好的纸片3张，以标准敏感菌株测其抑菌环，大小符合标准者则为合格。纸片的有效期一般为4～6个月。
（2）操作方法：K-B法是用含有一定量抗生素的药敏纸片，贴在已接种试验细菌的琼脂平板上，经37℃培养后，抗生素浓度梯度通过纸片上弥散作用而形成，在敏感抗生素的有效范围内，细菌的生长受到抑制，在有效范围外，细菌能够生长，故能形成一个明显的抑菌环。以抑菌环的大小来判定试验菌对某一抗生素是否敏感及敏感程度。
用接种环挑取菌落4～5个，接种于肉汤培养基中，置37℃培养4～6h。
菌液稀释：用灭菌生理盐水稀释培养液使浊度相当于硫酸钡标准管（配制方法：1.175％氯化钡0.5mL、1％硫酸溶液99.5mL，充分混匀，将此溶液置于与肉汤培养基相同的试管中，用前充分振摇）。
用无菌棉拭子蘸取上述肉汤培养液，在管壁上挤压，除去多余的液体，用棉拭子涂满琼脂表面，盖好平皿，在室温下干燥5min，待平板表面稍干即可放置含药纸片。
用灭菌镊子以无菌操作取出含药纸片贴在涂有细菌的平板培养基表面。一个直径9cm的平皿最多只能贴7张纸片，6张纸片均匀地贴在离平皿边缘15mm处，一张位于中心。贴纸片时要轻轻按压，以保证与培养基密切接触。将平皿放37℃恒温箱，培养16～18h，观察结果（如图6-1）。 结果判定：观察含药纸片周围有无抑菌环，量取其直径（包括纸片直径）大小，用毫米数记录，按抑菌环直径的大小报告敏感、中度敏感和耐药，具体标准见表6-3。
表6-3 抗菌药物的抑菌环与敏感标准
抗菌药物 丁胺卡那霉素 肠杆菌、肠球菌 葡萄球菌和青霉素敏感细菌 嗜血杆菌 杆菌肽 肠杆菌科 绿脓杆菌 先锋霉素I 氯霉素 氯林可霉素 粘菌素
复方甲氧异恶唑 红霉素 每片含药量(g)
耐药
10 10 10 10 10 100 100 30 30 2 10 25 15
≤11 ≤11 ≤10 ≤19 ≤8 ≤17 ≤13 ≤14 ≤12 ≤14 ≤8 ≤10 ≤13
抑菌环的直径（mm）
中等敏感 12～13 12～13 12～23
9～12 18～22 14～16 15～17 13～17 15～16 9～10 11～15 14～17
敏感 ≥14 ≥14 ≥24 ≥20 ≥13 ≥23 ≥17 ≥18 ≥18 ≥17 ≥11 ≥16 ≥18 庆大霉素 卡那霉素 甲氧苯青霉素 萘啶酸 新霉素 呋喃妥因 苯唑青霉素 青霉素G 葡萄球菌 其他细菌
10 30 5 30 30 300 1 10 10 300 10 300 300 10 30 2
≤12 ≤13 ≤9 ≤13 ≤12 ≤14 ≤10 ≤20 ≤11 ≤8 ≤11 ≤12 ≤12 ≤11 ≤9 ≤14
13～14 14～17 10～13 14～18 13～16 15～16 11～12 21～28 12～21 9～11 12～14 13～16 13～18 12～13 10～11 15～16
≥15 ≥18 ≥14 ≥19 ≥17 ≥17 ≥13 ≥29 ≥22 ≥12 ≥15 ≥17 ≥19 ≥14 ≥12 ≥17 多粘菌素B 链霉素 磺胺 四环素 妥布霉素 万古霉素 氯洁霉素
注意事项
1．稀释法
（1）接种量：接种细菌量的多少与MIC有一定关系。如用敏感的葡萄球菌对氯苄青霉素进行检测时，接种量增加1 000倍，MIC只略有增加，但对甲氧苯青霉素的敏感度则因接种量的不同而有较大变化，即使同一菌株，接种量小时为敏感，接种量增大时，其MIC则增加许多倍。
（2）培养基成分及培养条件：培养基的组成成分应保持恒定，外观清晰透明，pH值适宜。为了观察方便，还可向各管中加入葡萄糖及指示剂，以指示剂颜色的改变判定其是否生长。同时要注意选择适宜的培养温度，一般在12～18h观察药敏试验结果。如时间过长，细菌将会在高浓度的药物中生长。其原因，一是由于被轻度抑制的细菌开始繁殖，另一方面则是因为有些抗生素在37℃情况下不稳定，在其被破坏之后，受抑制的细菌也会再次生长繁殖。
（3）对于一些色泽深或本身呈混浊的中草药，其试管培养后不易观察细菌的生长情况。可从培养管移至平板培养基上，观察各管中的细菌是否被杀死。这种方法只能测定药物的最低杀菌浓度。
抑菌圈图示
含药纸片
抑菌圈
细菌菌苔 （4）稀释时，每一个稀释度均应更换吸管。菌液及抗生素的加量要准确。
2．扩散法
（1）K-B纸片扩散法必须使用Mueller-Hintion（MHA）培养基，因其解释度的数据是用此培养基积累的，MHA培养基普通冰箱可保存2～3周，用前须放37℃10min，以使形成的水雾干燥。此培养基适合于快速生长的细菌，生长缓慢的细菌或厌氧菌，不宜采用K-B技术及其解释标准。
（2）接种用的菌液浓度必须标准化，以细菌在平板上的生长恰呈融合状态为标准，接种后应及时贴含药纸片和放入35℃（或37℃）培养。
（3）培养的温度要恒定，时间为16～18h，结果不宜判读过早。因培养过久，细菌能恢复生长，使抑菌环变小。培养时不应增加CO2，以防某些抗菌药物形成的抑菌圈大小发生改变及影响培养基的pH值。
