暗视野光学显微镜
一、操作步骤
（1）．将显微镜上的视野调节旋钮旋至暗视野处
（2）．将光源亮度调至最大，使在低倍镜下所见的光环亮度最大。
（3）先在低倍镜下找聚光镜的光亮点或环形圈，并扭动暗视野聚光镜的调节杆，使亮点或环形圈移至视野正中。
（4）．在聚光镜镜面上滴加香柏油一滴,然后稍下降。将标本置载物台上,旋上聚光器使油与载玻片接触(不能有气泡产生)。
（5）．先用低倍物镜及7×目镜进行配光对准物体。调节聚光器的高度,首先在载玻片上出现一个中间有一黑点的光圈,最后为一光亮的光点,光点愈小愈好,由此点将聚光器上下移动时均使光点增大。
（6）．换上所需目镜和高倍镜,缓慢上升物镜进行调焦,至视野中心出现发光的样品。
（7）．在盖玻片上滴一滴香柏油,将油镜镜头浸在油中后调节物镜焦距处，再缓缓上下移动聚光镜高低，使物体发出最大亮度为止。
二、注意事项
（1）．进行暗视野观察时,聚光镜与载玻片之间滴加的香柏油要充满,否则照明光线于聚光镜上面进行全面反射,达不到被检物体,从而不能得到暗视野照明。
（2）．在进行暗视野观察标本前,一定要进行聚光镜的中心调节和调焦,使焦点与被检物体一致。
（3）．由于暗视野聚光镜的数值孔径都较大( NA=1．2—1．4),焦
点较浅,因此,过厚被检物体无法调在聚光镜焦点处,一般载玻片厚度为1．0mm左右,盖玻片厚度宜在0．16mm以下,同时载玻片、盖玻片应很清洁,无油脂及划痕,否则都会严重地扰乱最终的像。
三、基本原理
生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的,不易看清。暗视野显微镜的原理与来自缝隙的一束强光通过暗室时,可清楚地看到其中细微灰尘的现象是一样的,即给样品照明的光不直接穿过物镜,而是由样品上反射或折射的光进入物镜,那么,在漆黑的视野中,由于反差增大了,使样品能够看得更清楚。因用暗视野法可以在黑暗的视野中看到光亮的菌体,故在观察生活细菌及细菌运动时常采用此法。
暗视野显微镜的构造主要是采用一种特殊的聚光器,在聚光器的下方中央为圆形黑盘所遮,光仅由周缘进入,使光会聚于载玻片上,并斜照物体,物体经斜射照明后,发出反射光可进入物镜,这样,造成显微镜视野黑暗,而其中的物体明亮。如无暗视野显微镜时,只需将明视野显微镜上的聚光器取下,换上暗视野聚光器即可；也可在明视野显微镜聚光器下面的滤光镜支架上放一片星形挡板(star diaphragm)构成暗视野,这种方法适用于低倍镜观察。
在暗视野中,由于有些活细胞其外表比死细胞明亮,所以暗视野也被用来区分死、活细胞,此技术现已被用于各种酵母细胞的死、活鉴别。此外,暗视野显微镜对于观察娇弱的微生物,如梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)特别有用。
