研究报告 Research Report ITS鉴定木材种类：一例司法鉴定研究实例
黄欣
2周倩2,
3雷湘华2
高必达1,2,* 1湖南农业大学植物保护学院, 长沙, 410128; 2湖南农业大学司法鉴定中心, 长沙, 410128 *通讯作者, bdgao@aliyun.com 摘要：本研究选取一例非法收购国家重点保护植物油丹的司法鉴定案作为研究实例，在确认鉴定技术可行的前提下，应用ITS序列分析对待检测的原木做了分子鉴定。实验采用CTAB法提取原木DNA，对提取的原木DNA进行提纯，然后进行ITS rDNA的PCR扩增，再对PCR阳性产物进行克隆、测序，将测序结果进行Blast分析、构建系统发育树等。研究结果表明，送检的47根原木中有9根鉴定为油丹。本研究采用ITS序列系统发育分析方法，成功鉴定了原木种类，为今后类似司法鉴定案件审理提供了可靠的鉴定意见。 关键词：油丹, ITS序列, 分子鉴定, 司法鉴定
Identification of Plants by ITS Sequencing: A Judicial Case Study Huang Xin
2Zhou Qian2,
3Lei Xianghua2
Gao Bida 1,2,3*
1 College of Plant Proctection, Hunan Agricultural University, Changsha, 410128; 2 Judicial Center of Hunan Agricultural University, Changsha, 410128
Abstract Selecting one judicial identification case of illegal acquisition of Alseodaphne, a plant on the national protection list, as an example, this study,in the premise of feasible identifying technique, conducts a molecular identification on the object logs using ITS sequence analysis.The DNA of the object logs are extracted under the CTAB method and purified, then a PCR expansion of the ITS rDNA is conducted.Afterwards the PCR positive product is cloned and sequenced, on the the results of which a Blast analysis is done and phylogenetic tree construced.The outcome shows that 9 of the 47 submitted logs are Alseodaphne .In this study, the species of the logs are succefully identified using the phylogenetic analysis of ITS sequence fragment which provides a reliable expert opinion for similar forensic identification cases in the future.
Keywords: Alseodaphne, ITS sequence, Molecular identification, Judicial identification 木材鉴定技术对于打击非法采伐、保护珍稀濒危种材、合理保护森林资源具有重要意义(姜笑梅等, 2010)。为了更好地发挥木材鉴定技术在实际生产生活中的作用，近年来木材鉴定技术不断发展，特别是随着分子遗传学的发展，分子标记及DNA条形码技术逐渐成为一种物种辅助鉴定的工具，其在木材鉴定中的作用越来越受到人们的重视。其中ITS序列分析基金项目：本研究由公益性行业(农业)科研专项(201003031)和湖南省科技厅项目(2010NK3021)共同出资 第一作者：黄欣(1988-06-24)，男，湖南邵阳人，本科，主要从事生物信息学应用研究,huangxin8499@sina.com;
* 通讯作者：bdgao@yahoo.com.cn 在植物分类鉴定与系统进化中的应用越来越广泛(Finkeldey et al., 2010)。ITS序列之所以在植物种类鉴定及分子系统学中得到广发应用，其主要原因为ITS
1、ITS2分别位于18S-5.8S rDNA、5.8S-26S rDNA之间，而18S-5.8S rDNA、5.8S-26S rDNA的序列具有高度保守性，这样就可以用与它们序列互补的通用引物对ITS区进行PCR扩增、测序(赵玥等, 2005)，为进一步的分子鉴定提供良好的实验基础。2012年，湖南农业大学司法鉴定中心应海南省第一中级人民法院委托，对某非法收购国家重点保护植物油丹(Alseodaphne)案中47根原木样本进行司法鉴定。本研究在此应用背景下展开，运用ITS序列分子鉴定技术，成功鉴定了47根原木样本。
1结果与分析
1.1样品ITS序列PCR扩增结果
经特异性引物PCR扩增得到9个油丹阳性样品（编号
8、
16、
21、
25、
38、40、
41、
46、47），其余38个原木样品结果均为阴性（图1）。
图1 原木分子检测结果
Figure 1 Results of log molecular detection
1.2样品ITS序列扩增、测序结果
对9个PCR扩增阳性产物进行测序，所得ITS序列完全一致，均为471bp（图2）。
图2 PCR阳性产物的测序结果
Figure 2 Results of sequencing the positive PCR products
1.3样品ITS序列比对及系统发育树构建
对所测ITS序列进行BLAST比对，结果显示序列同源性（Max ident, 最后一列）在99%以上（包括99%）的全为油丹（图3），由此可以确认上述9个阳性产物的样品均为国家重点保护植物油丹。
图3 阳性样品ITS序列的Blast比对
Figure 3 Blast result of the positive samples ITS sequences
以NCBI中已有油丹属内各种ITS序列建树（图4，Actindaphne cupularis-HQ697213.1为外群），发现样品ITS序列与海南特有种皱皮油丹(Alseodaphne rugosa Merr.et Chun)亲缘关系最近，系统发育分析认为检测样品最可能为皱皮油丹，也进一步验证了分子鉴定结果的真实性。
图4 样品系统发育分析
Figure 4 Phylogenetic tree of segment of sample
2讨论
传统的木材鉴定主要是通过形态学的方法，但由于其自身具有一定的局限性，如鉴定工作周期较长、鉴定范围窄等，故通常鉴定不到种的水平(高昂等, 2012; 刘金良等, 2012)。目前，随着分子检测技术的不断发展，木材鉴定已经进入了分子生物学水平。由于ITS序列具有较好的保守性，同时含有较多的碱基信息，因此该片段能为木材的分子鉴定提供进一步可 靠的依据。赵志礼等(2000)阐述了核糖体DNA ITS区序列在植物分子系统学研究中的重要价值；马玉花等(2004)利用中国不同地区杜仲rDNA的ITS序列进行了分析测序；蔡金娜等(2000)对中国不同地区的蛇床进行了rDNA的 ITS序列分析；赵卫国等(2004)对桑属植物ITS序列进行系统发育分析；薛华杰等(2007)基于ITS序列对东亚当归属植物进行分类研究。以上应用实例均表明：基于ITS序列分析的分子鉴定技术具有快速、准确、灵敏度高等优点，并且已广泛应用于当前植物系统学的研究中。本文将ITS序列片段作为植物DNA条形码对检材样品进行了鉴定，结果表明ITS序列是一种适宜于木材鉴别的分子标记，本鉴定实例也为今后将ITS序列分析的检测技术广泛应用于木材鉴定领域提供了一个重要的理论基础。
3 材料与方法
3.1采集样品及编号
湖南农业大学司法鉴定中心确定受理此案后，于2012年11月28日指派一名执业资格鉴定人前往海南省陵水县取样，对原木进行编号，并测量各原木的直径和长度。11月30日回湘，12月3日将鉴定材料带回中心。
3.2实验试剂
（1）CTAB分离缓冲液：2% CTAB溶液，1.4 mol/L NaCL，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCL(pH8.0)，0.2% 巯基乙醇，1% PVP共100mL。
（2）北京天根生化科技有限公司DNA纯化回收试剂盒。
3.3样品DNA的提取及纯化
本中心对检材经液氮冷冻研磨后采用CTAB法提取DNA，具体操作步骤如下： (1) 将CTAB分离缓冲液置于60℃水浴中预热。
(2) 将削取的检材木屑置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将木屑研碎至粉末状。 (3) 将粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，在65℃水浴锅中保温60 min，期间多次轻轻转动使之混匀。
(4) 加等体积（10mL）的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），轻轻颠倒混匀5min。 (5) 室温下10000r/min离心10分钟。
(6) 吸取上清液至新的1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），轻轻颠倒混匀5min，室温下10000r/min离心10分钟。
(7) 吸取上清液至新的1.5 ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3 mol/L NaAc，轻轻混匀，-20℃放置1h，10000r/min离心10min。 (8) 弃上清液，用 70%乙醇洗涤两次。 (9) 小心倒去上清液，使DNA沉淀干燥。 (10) 将DNA沉淀溶于30uL dd H2O中。
(11) 将提取到的检材DNA用DNA纯化回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）纯化。
3.4PCR引物设计与扩增
参考Genbank核苷酸数据库中公布的油丹的ITS碱基序列，根据油丹的ITS碱基序列的结构特点及其保守区，用primer-BLAST工具设计油丹的特异性引物。正反向引物分别为：5\'-ACAACCGGCGAACCAGTC-3\'和5\'-ACGGTGTCCTCCTTTTCT-3\'。以样品基因组DNA为模板，进行50 μL反应体系PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸40 s，共36个循环，最后72℃延伸10 min。采用2.0%的琼脂糖对PCR扩增产物电泳检测。所得到的阳性产物送到上海生工生物技术公司测序。
3.5系统发育树的构建
运用Clustal X (version 1.83)的Alignment程序对所选序列进行多重对位排列(multiple alignments)，使用MEGA4.1软件进行遗传进化树的构建。采用Kimura2-parameter模式计算遗传距离，并将对位排列中的缺失数据(miing data)或空位(gaps)完全删除(complete deletion)，用邻位相连法(NJ, neighbor-joining)分析进化距离，并自展(bootstrap)1 000次重复检验。 作者贡献
周倩负责原木采样，雷湘华负责原木DNA提取与ITS序列扩增，黄欣负责ITS序列分析和论文写作，高必达负责实验指导。 致谢
感谢海南第一中级人民法院张鹂才采样中提供的帮助与配合。感谢两位匿名的同行评审人的评审意见和修改建议。
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