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吸附柱法提取血清血浆游离DNA 使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。 1.200 μL上述预处理的血清/血浆,不足200μL,可加缓冲液GA补足200 μL后进行下面的裂解步骤。
2.加入20 μL Proteinase K溶液,涡旋混匀。
3.加入200 μL缓冲液GB,充分颠倒混匀,加入1μL Carrier RNA(浓度1μg/μL,为避免反复冻融对Carrier RNA造成的损伤,应提前配好,分装置于-20℃储存备用),轻轻颠倒混匀,56℃孵育10 min,并不时摇动样品,简短离心以去除管盖内壁的液滴。注意:加入缓冲液GB后可能会产生白色沉淀,一般56℃放置时会消失,不会影响后续实验。如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。
4.加人200 μL乙醇(96-100%),如果室温超过25℃,请将乙醇置冰上预冷,轻轻颠倒混匀样品,室温放置5min,简短离心以去除管盖内壁的液滴。
5.将上一步所得溶液添加到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中),12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec,倒掉废液,将吸附柱CR2放回收集管中。
6.向吸附柱CR2中加入500 μL缓冲液GD (使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec,倒掉废液,将吸附柱CR2放入收集管中。 7.向吸附柱CR2中加入600 μL 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇), 12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec,倒掉废液,将吸附柱CR2放入收集管中。 8.重复操作步骤7。
9.将吸附柱CR2放回收集管中,12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min,倒掉废液。将吸附柱 CR2置于室温放置2-5min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注:这一
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步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验
10.将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加20μL洗脱缓冲液TE,室温放置2-5 min,12,000 rpm (~13,400×g)离心 2 min,将溶液收集到离心管中。 注:最后离心管中的洗脱液,重新吸入吸附柱CR2,再次洗脱离心,可以提高得率。
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