基因工程
添加时间：2008.10.29 | 作者：admin
基因工程实验注意事项
1． 上实验课的学生每三人分为一个小组。
2． 课前要预习实验内容，弄懂实验设计的原理，理清实验顺序。认真制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。
3． 实验指导中所写的实验
一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。各小组学生应根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。
4． 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。
5． 本实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在两周之内完成。
6． 实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！
7． 对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器和离心机！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。
8． 写作实验报告和实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻（包括操作的错误）。
9． 在实验室内不能大声喧哗。
10．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。
11．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验室。 12．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。 13．实验时损坏的任何物品都要及时申报。
实验流程参考图
PCR扩增CHI
制备感受态菌XL1-Blue
提质粒pBS-CHI，Pinpoint™xa-3 11ppMD18-TppMD18-T
EcoRV+BamHI酶切
与pUCm-T连接
转化XL1-Blue
筛选鉴定
提重组质粒pUCm-T-CHI
回收Pinpoint™xa-3
EcoRV+BamHI酶切
回收CHI片段
重组质粒Pinpoint™xa-3-CHI
IPTG诱导表达
SDS-PAGE检测
转化XL1-Blue
与Pinpoint™xa-3连接
Pinpoint™xa-3
pBS-CHI
XL1-Blue
XL1-Blue BL21（DE3）
筛选鉴定
提重组质粒Pinpoint™xa-3-CHI
转化XL1-Blue
重组质粒pUCm-T-CHI
第一部分质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定
实验一 质粒DNA的小量制备
1．目的
学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。 2．原理
根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。 3．器材
超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌器等。 4．试剂
Pinpoint™xa-3质粒载体菌，pBS-CHI载体菌，LB培养基1000ml（含100µg/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。 5．实验准备
氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200ml ddH2O 搅拌完全溶解，用约200ml 5N NaOH调pH至7.0，加ddH2O至1L，121°C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60ml 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd H2O至100ml），75%乙醇（-20°C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /ml RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121°C 30min）。 6．操作步骤
（1） 在超净工作台中取5ml LB（Amp），加入灭菌的摇菌试管中。
（2） 从超低温冰箱中取出保存Pinpoint™xa-3载体的菌种和pBS-CHI的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100µg/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37°C摇床中摇12~16h。
Pinpoint™xa-3菌： 接种于5ml LB（Amp）； pBS-CHI菌：接种于2ml LB（Amp）。 （3） 取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。
Pinpoint™xa-3菌：3管（3×1.5ml）； pBS-CHI菌：1管（1.5ml）。
（4） 在沉淀中加入100µl 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）
（5） 加入200µl 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。 （6） 加入150µl 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。
（7） 15000rpm离心5min，小心吸取400µl 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800µl 无水乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。 （8） 15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500µl 75%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净。
（9） 再加入500µl 75% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净。
（10） 离心管倒置于37°C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。 （11） pBS-CHI加入30µl 无菌蒸馏水或TE缓冲液； 3管质粒中每管加入10µl蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在Pinpoint™xa-3质粒中加入1µl RNaes A。用记号笔标记后放入冰箱中备用。
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r（12） 清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告。 7．思考
（1） 影响本实验结果的因素有哪些？
实验二 质粒DNA电泳鉴定
1．目的
学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。 2．原理
DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。 3．器材
电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。 4．试剂
Pinpoint™xa-3质粒，pBS-CHI载体，TAE电泳缓冲液，荧光染料，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液（或6´加样缓冲液），DNA分子量标准（DL2000）。 5．实验准备
配制TAE电泳缓冲液（50´储存液，pH约8.5：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，ddH2O 定容至1L），10´加样缓冲液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；6´加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。 6．操作步骤
（1） 称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1´)，放入微波炉中烧开（1min）。50ml 正好倒两块小胶。 （2） 注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。 （3） 戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50~60°C）。
（4） 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10~20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。
（5） 在水平电泳槽中加满1´TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。
（6） 待胶完全凝固后（15~20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。 （7） 剪1片光面纸（或封口膜），点6µl蒸馏水、1µl 10´加样缓冲液，再加入3µl质粒DNA溶液制成10µl DNA样品。
（8） 在凝胶上选择相邻的加样孔。用10µl的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3µl DNA分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。
（9） 打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30分钟。
（10） 当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。 （11） 把凝胶放入凝胶成像系统中拍照。
（12） 清理桌面垃圾，清洗实验仪器，撰写实验报告。 7．思考
（1） 泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？ （2） 溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA? （3） 影响本实验结果的因素有哪些？
实验三 质粒DNA的酶切
1．目的
学会用限制性内切酶切割质粒DNA。 2．原理
II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。 3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。 4．试剂
Pinpoint™xa-3质粒，EcoR V，BamH I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲液，荧光染料。 5．实验准备
配制TAE电泳缓冲液（50´储存液），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。 6．操作步骤
（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中： Pinpoint™xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl 10×酶切缓冲液（用EcoRV的缓冲液）
2 μl ddH2O 30 μl EcoRV 1μl BamHI 1μl 总体积 40μl
（2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。 （3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μl限制性内切酶。 （4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1~3 h（一般是 37℃）。
（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。
（6）酶切后的质粒可以回收备用（见实验六：从琼脂糖凝胶中回收DNA片段）。 （7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。 7．思考
（1）酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？
（2）如何估计DNA用量和酶的用量？
（3）在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？
第二部分 目的基因的获得和重组载体的构建
实验四 PCR扩增制备目的基因
1．目的
学会PCR操作的基本技术。 2．原理
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）倍。其中
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。 4．试剂
n 5U/μl Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pBS-CHI，无菌ddH2O。 5．实验准备
dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，荧光染料，10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。
合成的引物：Sense primer 5＇-GGATCCACAATGATGAGAGCC-３＇
Antisense primer ５＇-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-３＇
目的基因模板质粒：已经克隆在pBS载体上的1128bp几丁质酶（chitinase，CHI）基因。
待扩增的CHI片段长度：996bp。 6．操作步骤
（1） 在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）
ddH2O 32μl
10×PCR buffer（不含MgCl2）
5μl
25mM MgCl2 3μl
2.5mmol/L dNTP 4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 2μl（12.5~25pmoles）
10μmol/L primer2 2μl（12.5~25pmoles）
模板质粒 1μl（1×10pmoles）
5U/μl Taq酶 1μl（5U）
总体积
50μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
-3 ① 94℃ 5min ② 94℃ 1min ③ 54℃ 1min ④ 72℃ 1min50s ⑤ goto② 29 times ⑥ 72℃ 10min （3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。 （4）清理桌面，撰写实验报告。
（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。 7．思考
（1）复性温度如何确定？
（2）为什么要在最后延伸10min？
（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？
实验五 目的基因片段与载体连接
1．目的
学会DNA片段的体外连接技术。 2．原理
在Mg和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。 3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。 2+4．试剂
pUCm-T 载体，Pinpoint™xa-3酶切载体，CHI插入片断，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddH2O。
5．实验准备
1.5ml离心管装入饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基（含Amp）。 6．操作步骤
1）PCR产物与pUCm-T载体直接连接：
（1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14～16°C。 （2） 取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入： 4μl PCR 产物混合液 1μl pUCm-T载体
0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 1μl 连接酶缓冲液 3.5μl ddH2O 总量 10μl 体系
（3） 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16°C水中保温过夜。 （4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
2）DNA回收片断（CHI）与载体（Pinpoint™xa-3）连接： （1） 取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入 4μl 回收DNA片断 1μl 酶切后回收的载体
0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 1μl 连接酶缓冲液 3.5μl ddH2O 总量 10μl 体系
（2） 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16°C干式恒温仪（或16°C水中）中保温过夜。 （3） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。 7．思考
（1）连接酶的最适温度室多少？
（2）为什么要采用16°C下连接？
（3）如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？
实验六 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
1．目的
学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的基本技术。 2．原理
限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA酶切片段。 3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴。 4．试剂
电泳缓冲液，荧光染料，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液，DNA分子量标准（DL2000），DNA凝胶回收试剂盒。 5．实验准备
配制TAE电泳缓冲液（10´储存液），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）； 6．操作步骤 （1）用1´TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。
（2）在胶上选定两个加样孔，分别加入少量（10μl）和大量（50μl ）DNA酶切产物，电泳。
（3）电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边缘），在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意：含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用加荧光染料，也不用紫外灯照射！
（4）将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。
（5）按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。 纯化/回收试剂盒组成：
溶液A：6M NaClO4，0.03M NaAc，pH5.2，少量酚红；
溶液B：3M NaAc；
溶液C：用时加入35ml无水乙醇；
溶液D：TE缓冲液。 胶回收步骤如下：
① 将切下的胶带放入1.5ml离心管中，按照1：3 (胶带重量：溶液A的体积)的比例加入溶液A；
② 50℃水溶10min，胶带完全要求完全溶化，其间可振荡助溶2～3次，待溶化后置室温加入15μl溶液B，充分混匀；
③ 将溶液置于离心柱中，静置2min，10000rpm离心20s；
④ 倒掉液体，加入500μl溶液C于离心柱中10000rpm离心20s，弃液体，重复该步骤一次；
⑤ 12000rpm离心1min，甩干剩余液体以除去残余乙醇；
⑥ 将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5～10min，使乙醇挥发殆尽； ⑦ 加入20～30μl溶液D(使用前50℃水浴)，静置2min；
⑧ 12000rpm离心1min，管底溶液即为所需DNA，将DNA贮存于-20℃可长期保存。 （6）清理桌面，撰写实验报告。 7．思考
（1）为何避免用荧光染料染色和用紫外灯照射目的DNA？
第三部分 感受态细胞的制备和转化及筛选鉴定
实验七 感受态菌的制备
1．目的
学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。 2．原理
细菌在0℃ CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。 3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。 4．试剂
E.coli XL1-Blue，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌ddH2O 5．实验准备
1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），无菌ddH2O，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。 6．操作步骤
（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB（不含抗菌素！）培养基。
（2）从超低温冰柜中取出XL1-Blue菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。 （3）取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2~3h，测定OD600为0.375（
（4）将菌液分装到1.5ml预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心10min。
（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。
（6）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。
（7）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100ml分装到1.5ml离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。
（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。 7．思考
（1）制作感受态菌的过程中，应注意那些关键步骤？
（2）CaCl2溶液的作用是什么？
实验八 细菌转化
1．目的
学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。 2．原理
质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 3．器材
8旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。 4．试剂
LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。 5．实验准备
无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。 6．操作步骤
（1） 事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2） 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3） 加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。 （4） 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。 （5） 在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。
（6） 在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。 （7） 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
（8） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
（9） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。
（10） 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。 7．思考 （1）影响转化效率的因素有哪些？
（3）白色菌落出现的原理是什么？
实验九 转化克隆的筛选和鉴定
1．目的
学会用酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。 2．原理
利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片段的克隆菌落。 3．器材
旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。 4．试剂
LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，70%甘油（70%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris-HCl pH8.0）。 5．实验准备
无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/ml氨苄青霉素。 6．操作步骤
方法一：酶切鉴定
（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3ml LB（含50mg/ml氨苄青霉素），用记号笔写好编号。 （2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3ml LB（含50mg/ml Amp）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。
（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。 （4）将提取到的3管质粒样品与空质粒同时电泳，根据分子量判断和选区有插入片段的质粒，然后可用酶切、与目的片段一同电泳来鉴定其上的外源插入片段大小是否与预期相符。
（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500ml菌液与500ml 70%甘油混合后-80℃保存。 （6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。 方法二：快速PCR筛选法
（1） 在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。
（2）在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。
ddH2O 16μl
10×PCR buffer（不含MgCl2） 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 1μl（12.5~25pmoles）
10μmol/L primer2 1μl（12.5~25pmoles）
Taq酶 0.5μl（1.5U）
总体积 25μl
模板质粒： 用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗。 （2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
① 94℃ 5min ② 94℃ 1min ③ 54℃ 1min ④ 72℃ 1min50s ⑤ goto② 29 times ⑥ 72℃ 10min （2） PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片段同时比对）。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（3） 按照编号找到培养皿中的原菌斑，根据需要进行放大培养提取其质粒。
（4） 提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，用酶切以进一步确认。
7．思考
（1）PCR法筛选的优点和缺点是什么？ （2）酶切法与PCR法筛选方案哪个更可靠？
（3）最终确认克隆的方法有哪些？
第四部分 目的基因在原核细胞中表达与SDS-PAGE鉴定
实验十 外源基因的诱导表达
1．目的
了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。 2．原理
外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长，lac I产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。 3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。 4．试剂
LB培养基（加抗菌素），100mg/ml IPTG，20%葡萄糖。 5．实验准备
无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/ml IPTG （过滤灭菌）（100ml分装，-20°C保存），100mg/ml氨苄青霉素（过滤灭菌）（100ml分装，-20°C保存），配制20%葡萄糖（8磅灭菌20分钟，添加至上述LB中，终浓度为0.2%）。 6．操作步骤
（1） 晚上9：00接种。在超净工作台中接种含有Pinpoint™xa-3-CHI重组载体的菌株，培养于两个三角烧瓶各20ml LB-葡萄糖培养基（含抗菌素Amp 120μg/ml）的摇菌管中，慢速70~90转/分钟30°C摇菌过夜。
（2） 至第二天上午8：30 OD600约为0.5，加IPTG至 100μg/ml，150~170转/分钟37°C诱导1.5-3h。同时做不加IPTG诱导和非转化的空菌诱导的对照培养。
（3） 4000rpm离心15min弃掉上清液，收获菌体，用SDS-PAGE电泳分析（表达蛋白分子量为30kDa）。菌体也可放在-20°C以下保存备用。
（4） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。 7．思考
（1）IPTG的作用原理是什么？
（2）为什么要增加抗菌素的用量？
实验十一 SDS-PAGE检测表达蛋白
1．目的
学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白。 2．原理
蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗。 3．器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，超声波破碎仪，电磁炉，电泳仪，垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等。 4．试剂
SDS（十二烷基磺酸钠），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺），Tris（三羟甲基氨基甲烷），甘氨酸，盐酸，Aps（过硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量标准（97.4，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3 kDa），溴酚蓝，甘油，冰醋酸，乙醇，b-2-巯基乙醇，考马斯亮蓝R250，甲醇，乙醇。 5．实验准备
1.0mol/L Tris HCl，pH8.8（4°C保存）；0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8（4°C保存）；10%SDS（室温保存）；30%Acr/Bis（30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100ml，4°C保存）；10%Aps （-20°C保存）；2´上样缓冲液（0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2ml，甘油2ml，20%SDS 2ml， 0.1%溴酚蓝 0.5ml，b-2-巯基乙醇 1.0ml，ddH2O 2.5ml，室温存放）；5´电泳缓冲液（Tris 7.5g ，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加ddH2O至500ml，使用时稀释五倍）；考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R250 0.25g + 45ml甲醇+10ml冰醋酸，用ddH2O定容至100ml）；脱色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，体积比）； 6．操作步骤
（1） 将表达后的菌体与2´上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中。
（2） 用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定要将超声波探头插入溶液底部，在溶液表面或上部时容易起泡！
（3） 将上述微量离心管插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮3~5min。然后立即插入冰中。（可在-20°C冰柜中保存）。
（4） 按照教师的演示组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住（不能夹玻璃的上端以免夹断玻璃的突出段！）。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm的地方做一个标记。 （5） 配制10%分离胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为 pH8.8）：
Acrylamide-bis 3.96 ml 1M Tris PH8.8 4.38 ml ddH2O 3.432 ml 10% SDS 118.8 μl
TEMED 9.9 μl 10%APS 118.8μl
（6） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满ddH2O（尽可能不破坏下面的胶液）。然后静置30min。直到烧杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸馏水，并倒置玻璃尽可能将水倒尽。
（7） 配支持胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为 pH6.8）：
Acrylamide-bis 0.675 ml 0.5M Tris pH6.8 0.563 ml ddH2O 3.165 ml 10% SDS 45 μl TEMED 7.5 μl 10% APS 45μl
（8） 加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20min。烧杯中剩下的溶液倾斜放置直到溶液凝固。（此状态可以用塑料薄膜包起来放入冰箱过夜）。
（9） 小心拔出梳子以后，用注射器针头（剪平尖部）吸取梳子齿形成的加样槽中的水，并修平加样槽底部的胶面。
（10） 选取几个形态好的加样槽，在一张纸上做好对应的标记，用微量移液器在侧面的一个加样槽中加入20μl 蛋白分子量标准Marker，其它槽中加入10～20μl自己制作的样品。 （11） 加完样品后，再用微量移液器吸取电泳缓冲液小心把加样槽液面都补平。电泳槽上部倒满电泳缓冲液（约250ml,淹没过加样槽的液面！），电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液（约180ml）。
（12） 接好电极，将电流调至10mA，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电流调至18mA，电泳约2~3h，期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏（泄漏导致液面下降，电流中断）！当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源。
（13） 在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液。
（14） 倒掉电泳槽中的缓冲液，取下玻璃，小心用铲子从下部将带有缺口的玻璃板撬起（切不可损坏胶！）。用铲子切去上部的支持胶，并把分离胶从玻璃上剥离倒染液搪瓷盘里（切不可损坏胶！）。 （15） 染色2h后，将染液倒回瓶子里以备重复使用。把胶移入脱色液，过夜。
（16） 观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量（CHI蛋白约30kDa），判断是否是预期的基因产物。 （17） 清理桌面，写实验报告。 7．思考
（1）影响表达的因素都有哪些？
（2）如何确定凝胶上的某条蛋白质带就是所要表达的外源基因产物？ （3）表达产物的形式是包涵体还是可溶性蛋白？
（4）本实验能否判断表达产物一定是CHI蛋白？还需要什么方法？ （5）如何估计表达产物的分子量？
附录1：表达载体Pinponit™xa-3的图谱：
附录2：所用的chitinase（玉米几丁质酶）序列（GenBank：L00973）：
>L00973
gcaacaccag cttctctaaa gatcacaatg atgagagccc tggcgtggtg gccatgctgg cccgccttct tcgctgtgcc cgctcgcgcc gagcagtgcg ggtcgcaggc cggcggcgcg ctgtgcccca actgcctgtg ctgcagccag ttcgggtggt gcggcagctc cgactactgc ggcagcgggt gccagagcca gtgcagcgca gcctgcagca ccccgaaccc gccgagcagc ggcggcgtgg cgtccatcat ccccgagtcg ctcttcaacc agatgctgct gcaccgcaac gacgcggcgt gccccgccaa cggcttctac acctacgcgg gcttcatcgc ggcggccaac gcgttcccgg gcttggcacc acgggtgcgg cccgacgtgc agaagcgcga gctggcggcg ttcctggcgc agacgtccca cgagacgacg ggcgggtggg cgacggcgcg acggccctac gcctggggct actgcttcaa ggaggagcag ggcggcgcgt cggggccgga ctactgcgag cccagcgccc agtggccgtg cgccgcgggg aagaagtact acgggccgcg ggccatccag atctccatca acatcaacat cgggcccgct ggcaggccat cggcgcccgg catcctcgcc aacccggacc tggtggccac ccgaccccac cgtgtcgttc gaagaccgcc gtctggttct gggatgaccc cgcagtcgcc caagccgtcg tgcaccgacg tcatgacggg gcagtggacg ccctccgccg ctgacacggc cgccggcagg ctgccgggct acggcgtcgt caccaacatc tccaacggcg gcctcgagtg cggccatggc gctgacagcc gcgtcgccga ccggatcggc ttctacaaac gatactgtga cttgcttggg gtcagctacg gcgacaactt ggactgcgcc aaccagacgc ctttcaacgg ctagttaata agctagctac ctcaccatgc atgtctgcct tattattaga gacacaataa gacctgatcg atatgatgat gggtatgcat gtattacttt actacacgca gatccagcaa tcaagaataa agcaaattaa tgtttact
附：
DL2000分子量标准（bp） 低分子量蛋白质Marker（kDa）
附录3：本实验所用的pUCm-T克隆载体图谱
选做实验
实验一 拟南芥基因组DNA的分离提取
【实验目的】
F 掌握拟南芥基因组DNA的抽提原理和方法。 【实验原理】
通常采用机械研磨的方法破碎拟南芥的组织和细胞，由于拟南芥细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异戊醇使DNA沉淀，即得拟南芥总DNA。 【实验器材】
F 试剂耗材：提取液（0.2M Tris-HCl(pH7.5)、0.5%SDS、0.25M NaCl、1%β-巯基乙醇）、异丙醇、氯仿、异戊醇、RNAase A、研钵、液氮、1.5ml离心管。 F 仪器：恒温水浴锅、离心机。 【方法步骤】
（1） 取新鲜的拟南芥叶片2~3片加入1.5ml的离心管中，加入液氮，玻璃棒研碎。 （2） 研磨以后，加入600~700µl的提取液，混匀，然后在60℃下水浴20~60分钟。 （3） 4℃，12000rpm/min离心10分钟。
（4） 把上清转至新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），4℃，12000rpm/min离心7分钟。
（5） 把上清转至新的离心管中，加入70%体积的异丙醇，混匀，4℃，12000rpm/min离心15分钟。 （6） 弃上清，70%乙醇洗涤沉淀2次，吹干。
（7） 沉淀用20~30µl含有0.1mg/ml RNAase A的ddH2O溶解。 （8） 用0.8%的琼脂糖凝胶检测提取的拟南芥总DNA。 【实验结果】
1.拟南芥总DNA的电泳结果。 【实验思考】
1.依据你的理解，拟南芥总DNA的提取过程中应注意那些操作？ 【参考文献】
邹华文，黄丛林.一种简单快速的拟南芥基因组DNA的微量提取方法.长江大学学报B（自然科学版），2006，4 .
实验二 果蝇白眼突变基因的克隆
【实验目的】
F 掌握T克隆的原理和方法。 F 了解质粒提取的原理和方法。 【实验原理】
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。 【实验器材】
F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。
2+F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。 【方法步骤】
（一） 引物设计
从NCBI上下载果蝇的白眼突变基因序列（GenBank登录号：X51749），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
（二） 目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：
模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：
94℃预变性4min；
94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。
（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
（四）目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下： 纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
（五）连接产物的转化
(1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化； (2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min； (3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
(4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
(5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
(6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
（六）重组质粒的筛选
分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
(1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净； (2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
(3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
(4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应； (5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
(6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟； (7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管； (8) 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min； (9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min； (10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；
(11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。 (七) 重组质粒的测序验证
将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。 【实验结果】
2.目的基因的PCR电泳结果。 3.质粒电泳结果。 4.测序验证结果。 【实验思考】
1.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。
2.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。 3.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。
4.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。 【参考文献】
1.J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002.2.Pepling M, Mount S M.Sequence of a cDNA from the Drosophila melanogaster white gene.Nucleic Acids Res.1990,18(6):1633.
实验三 家蚕油蚕突变基因的克隆
【实验目的】
F 掌握T克隆的原理和方法。 F 了解质粒提取的原理和方法。 【实验原理】 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。 【实验器材】
F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。
F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。 【方法步骤】
（三） 引物设计
从NCBI上下载家蚕油蚕突变基因序列（GenBank登录号：AB060285），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
（四） 目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：
模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：
2+ 94℃预变性4min；
94℃变性40s，48℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。
（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
（四）目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下： 纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
（五）连接产物的转化
(1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化； (2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min； (3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
(4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
(5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
(6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
（六）重组质粒的筛选 分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
(1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净； (2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
(3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
(4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应； (5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
(6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟； (7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管； (8) 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min； (9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min； (10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；
(11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。 (七) 重组质粒的测序验证
将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。 【实验结果】
5.目的基因的PCR电泳结果。 6.质粒电泳结果。 7.测序验证结果。 【实验思考】
5.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。
6.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。 7.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。 8.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。 【参考文献】
1.J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002.2.Kômoto N.deleted portion of one of the two xanthine dehydrogenase genes causes translucent larval skin in the oq mutant of the silkworm (Bombyx mori).Insect Biochem Mol Biol.2002 ,32(6):591-597.
实验四 拟南芥叶片花斑突变基因的克隆
【实验目的】
F 掌握T克隆的原理和方法。 F 了解质粒提取的原理和方法。 【实验原理】
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。 【实验器材】
F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。
F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。 【方法步骤】
2+
（五） 引物设计
从NCBI上下载拟南芥叶片花斑突变基因序列（GenBank登录号：NM_123592），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
（六） 目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：
模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：
94℃预变性4min；
94℃变性40s，45℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。
（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
（四）目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下： 纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
（五）连接产物的转化
(1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化； (2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min； (3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
(4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
(5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
(6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
（六）重组质粒的筛选
分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
(1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净； (2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
(3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
(4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应； (5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
(6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟； (7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管； (8) 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min； (9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min； (10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥； (11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。 (七) 重组质粒的测序验证
将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。 【实验结果】
8.目的基因的PCR电泳结果。 9.质粒电泳结果。 10.测序验证结果。 【实验思考】
9.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。
10.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。 11.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。
12.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。 【参考文献】
1.J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002.2.Sakamoto W, Tamura T, Hanba-Tomita Y, et al.The VAR1 locus of Arabidopsis encodes a chloroplastic FtsH and is responsible for leaf variegation in the mutant alleles.Genes Cells.2002,7(8):769-780.
实验五 线虫unc-22突变基因的克隆
【实验目的】
F 掌握T克隆的原理和方法。 F 了解质粒提取的原理和方法。 【实验原理】 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。 【实验器材】
F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。
F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。 【方法步骤】
（七） 引物设计
从NCBI上下载线虫unc-22基因序列（GenBank登录号：NM_069873），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
（八） 目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：
模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：
2+ 94℃预变性4min；
94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。
（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
（四）目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下： 纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
（五）连接产物的转化
(1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化； (2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min； (3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
(4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
(5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
(6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
（六）重组质粒的筛选 分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
(1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净； (2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
(3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
(4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应； (5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
(6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟； (7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管； (8) 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min； (9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min； (10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；
(11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。 (七) 重组质粒的测序验证
将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。 【实验结果】
11.目的基因的PCR电泳结果。 12.质粒电泳结果。 13.测序验证结果。 【实验思考】
13.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。
14.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。 15.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。 16.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。 【参考文献】
1.J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002.2.Wang,W.and Shakes,D.C.Isolation and sequence analysis of a Caenorhabditis elegans cDNA which encodes a 14-3-3 homologue.Gene.1994, 147 (2), 215-218.
