龙源期刊网 http://www.daodoc.com 拟南芥中Fibrillarin基因的克隆•表达•纯化及与ak6蛋白相互作用研究
作者：李然 田兆丰 张飞云
来源：《安徽农业科学》2014年第01期
摘要[目的]研究拟南芥中Fibrillarin基因的克隆、表达及纯化，并探索其与ak6蛋白的相互作用。[方法]利用pGEX6P1与Fibrillarin基因构建重组表达质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，运用同样方法构建PET28aak6原核表达质粒，获得Hisak6融合蛋白，并运用体外pull down技术验证二者的相互作用。[结果]在温度为37 ℃、诱导时间为16～20 h、IPTG浓度为0.5 mmol/L时，fibrillarin蛋白的纯化浓度最高。试验成功获得了符合标准的RNA，并获得了与预期片段大小相符的清晰的目的条带；pulldown试验结果表明，拟南芥中fibrillarin蛋白与ak6蛋白具有相互作用。[结论]拟南芥ak6突变体植株可能由于ak6的缺失影响了rRNA前体的加工，从而抑制核糖体的合成，进而阻碍拟南芥茎的生长，使植株表现明显的矮小症状。
关键词拟南芥；fibrillarin蛋白；ak6 中图分类号Q785文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00020-04 基金项目国家自然科学基金项目（31071075）。
作者简介李然（1988- ），女，河北承德人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学，Email：lran1988@163.com。*通讯作者，副教授，硕士生导师，从事植物分子生物学和植物分子病毒学研究，Email：feiyun39@126.com。
收稿日期20131209随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来，对人体内一些结构和功能未知蛋白质的研究已经成为一个热点，因为通过对这些蛋白质的研究可以使人类更进一步地认识自己，从而为人类一些相关疾病的预防和治疗提供重要的理论基础。
核糖体RNA，即rRNA，是最多的一类RNA，占RNA总量的82%左右，其也是3类RNA（tRNA、mRNA和rRNA）中相对分子质量最大的一类RNA，能与蛋白质结合形成核糖体。其功能是作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，实现蛋白质的合成，单独存在时不执行此功能。rRNA可与多种蛋白质结合形成核糖体，作为蛋白质生物合成的“装配机”。研究帮忙，拟南芥fibrillarin蛋白是核小核糖核蛋白颗粒（snRNP）中的组分，结合于U
3、U
8、U13 snRNP的RNA，参与rRNA前体的第一步加工，从而调控蛋白质的翻译过程。拟南芥ak6突变体植株较拟南芥野生型植株明显矮小。
龙源期刊网 http://www.daodoc.com 腺苷酸激酶（Adenylate kinase，AK）是一种核苷酸单磷酸激酶（Nucleoside monophosphate kinases，NMPKs），广泛存在于生物体中，能可逆地催化γ磷酸基团的转移（通常作用于ATP），将ATP和AMP反应，生成2分子的ADP，以此来维持细胞内的能量平衡[1]。因此，腺苷酸激酶在细胞的新陈代谢以及DNA和RNA的合成中扮演着重要的角色。目前已经发现并深入研究了其前5种亚型（AK1～AK5）。研究表明，这些酶在核苷酸的合成中起着重要的作用，在各种细胞代谢过程中都是必需的[11-12]。由于腺苷酸激酶涉及细胞中核苷酸的合成与代谢，所以对治疗用的核苷和核苷类似物的化疗药物进行活化及代谢也是必需的。ak6是Hui Ren（2004）等在人体肾上腺中发现了一个定位于细胞核的新型腺苷酸激酶[7]。目前，AK6基因已在大多数动物如人类、果蝇、线虫以及酵母中有了较深入的研究，但在植物中鲜有报道，课题小组前期的研究表明，aak6-/aak6-突变体植株与野生型植株相比，突变体植株表现明显的矮小状况[13-14]。
fibrillarin蛋白参与rRNA前体的加工过程，影响植株的能量代谢，推测可能影响拟南芥的生长状况。笔者构建了fibrillarin蛋白的表达载体，并对其进行表达、纯化，然后用体外pull-down、SDS-PAGE和western blot检测技术，探究拟南芥中fibrillarin蛋白与ak6蛋白是否存在相互作用，以期找到突变体植株矮小的原因。 1材料与方法 1.1材料
1.1.1菌株和质粒。pET28a载体、pGEX6P1载体、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α与TOP
10、BL21（DE3），均为实验室保存。
1.1.2主要试剂。Trizol，购自美国TELTEST Inc；逆转录试剂盒，购自Fermerters公司；高保真PCR试剂盒、随机引物和TA cloning 试剂盒，均购自全式金公司；各种构建载体所需工具酶（如限制性内切酶、TapDNA聚合酶、T4连接酶等），均购自Takala公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自QINGEN公司。 1.2方法
1.2.1RNA提取、反转录及检测。以生长4周左右的拟南芥（未抽薹）的叶片为材料，用Trizol法提取总RNA，并用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。
1.2.2Fibrillarin基因的扩增。根据GenBank中ig52490序列利用PrimerPremier5.0设计引物，上游BamH1 酶切位点，下游加入EcoR1酶切位点，引物序列为：
以制备好的拟南芥cDNA为模板，扩增体系为50 μl。反应程序：预变性：94 ℃，5 min；变性：94 ℃，30 s；退火：58 ℃，40 s；延伸：72 ℃，1 min；30个循环后，72 ℃，5 min。反应结束后，取出4 μl进行电泳，检测是否扩增出目的片段，检测到目的片段后用胶回收试剂盒进行回收。
龙源期刊网 http://www.daodoc.com 1.2.3原核表达质粒的构建和鉴定。将纯化后的PCR产物和pGEX6P1分别用限制性内切酶BamH1和EcoR1进行双酶切，胶纯化回收以后将PCR产物与pGEX6P1线性片段连接，16 ℃连接过夜，连接体系如表1所示。
将连接产物转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，37 ℃活化1 h后涂LB AMP抗性平板，置37 ℃培养箱中倒置培养。转化后，用抗生素筛选后的单克隆进行如下程序检测：菌落PCR筛选-酶切检验-测序，最终找出正确的重组克隆。
1.2.4重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化。将测序结果正确的重组质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞表达菌株，将表达检测成功的样本接种到200 ml含50 μg/ml氨苄霉素的LB培养基中，于37 ℃，200 r/min过夜培养，然后以1∶20接种到大瓶LB培养基中，37 ℃继续培养至OD600nm为0.6，然后加入0.5 mmol/L的IPTG诱导，于16 ℃培养 16 h；然后于8 679 r/min，10 min低温离心，弃掉上清；用5.0 ml PBS悬浮沉淀，超声破碎，在4 ℃，14 000 r/min 离心30 min，收集上清，上清和沉淀分别留少许样进行SDSPAGE检测。在上清中加入适量GST beads，于4 ℃旋转令其吸附蛋白2.5 h；于4 340 r/min，3 min离心弃上清；加入至少50 ml的PBS溶液，轻摇至beads悬浮于溶液中，于4 340 r/min，离心3 min，弃上清；重复用PBS洗beads 2次；加入1.0 ml的GST Elution Buffer，轻摇10 min；于4 340 r/min，离心3 min，收集上清；重复用 GST Elution Buffer洗2次，收集上清进行SDSPAGE检测，进行SDSPAGE电泳检测。
1.2.5ak6蛋白的制备。采用“1.2.4”中方法获得表达的拟南芥。
1.2.6体外pulldown寻找与fibrillarin相互作用的蛋白及免疫检测。用200 μl的GST beads和1.0 ml的GSTfibrillarin蛋白在4 ℃混合，将过表达的HISAK6蛋白混合液加入经处理的GST beads中，在4 ℃旋转混合孵育10 h，用冰冷的细胞裂解液重复洗涤3次，然后采用SDSPAGE方法对结果进行检测。将跑好的胶在冰浴中转PVDF膜1 h，再将膜从电转槽中取出，依次用去离子水和PBST稍加漂洗，然后浸没于封闭液（脱脂牛奶）中，于4 ℃缓慢摇荡1 h；然后加一抗（AK6单抗），4 ℃摇动孵育12 h过夜；用PBST洗膜3次，每次5 min；之后加入羊抗鼠二抗，用PBST再洗膜3次，每次15 min；最后进行自显影。 2结果与分析
2.1总RNA的提取及反转录用Trizol从拟南芥的叶片中提取RNA，根据检测的浓度利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，保存在-20 ℃备用，结果表明成功获得了符合标准的RNA（图1）。 2.4.1ak6引物。
2.4.2载体构建和重组蛋白的表达纯化。成功构建原核表达质粒pET28aak6获得ak6蛋白，其中载体pET28a中带有HIS标签，用ak6的单克隆抗体作为后续pulldown试验中进行
龙源期刊网 http://www.daodoc.com western blot检测所以的一抗，鉴定ak6蛋白，从而证明拟南芥中fibrillarin蛋白与ak6蛋白具有相互作用。
2.5核糖体组成蛋白fibrillarin与ak6相互作用将纯化后的HISak6融合蛋白和GST fibrillarin融合蛋白及pGEX6P1蛋白同时加入到GST beads中，4 ℃共同孵育10 h，经离心收集洗脱复合物和洗涤后，取胶，在冰浴中转PVDF膜2 h，再加入ak6单克隆抗体过夜，洗脱，加二抗，最后进行自显影，结果如图5所示，证明二者存在相互作用。
试验选取拟南芥作为研究对象，构建了fibrillarin蛋白的表达载体，通过对诱导温度、诱导时间、IPTG浓度等条件的摸索，发现在温度为37 ℃、诱导时间为16～20 h、IPTG浓度为0.5 mmol/L时，fibrillarin蛋白的纯化浓度最高。
生物体进行一系列的生命活动需要化学能，而这些化学能的获得绝大部分是来自于ATP。ATP是一种高能化合物，通过一系列的代谢过程，例如糖酵解、三羧酸循环以及氧化磷酸化来产生。ATP的能量转移使得动植物的各种重要生命活动有了能量来源，如肌肉收缩、神经信号的传导、主动运输等，保持着生物体生命活动的正常进行。利用ATP转移走一个磷酸基团生成ADP，然后ADP再获得一个磷酸基团生成ATP，以此完成ATP的利用循环。换言之，这种以ATP为中介物的生成与再利用循环是生物体能量流动的核心，并以此维持着生物体的各项生命活动。
ak6是腺苷酸激酶的一种，根据前人研究，除酵母外，人类、线虫、果蝇中的ak6的同源蛋白都具有激酶活性[9-10]，能使所有类型的NTPs和dNTPs充当磷酸供体，为细胞代谢提供能量。课题组为探索缺失ak6的突变体植株与野生型相比长势矮小的原因，通过体外试验寻找与ak6蛋白具有相互作用的功能蛋白。由于在进行pulldown试验时加入的是GST beads，那么在收集的上清液蛋白中，只可能存在带有GST标签的蛋白以及与其发生相互作用的蛋白，westblot检测时加入ak6抗体，使HISAK6融合蛋白与之结合，结果表明抗体是与ak6结合而不是与GST标签结合，从而证明拟南芥中fibrillarin蛋白与ak6蛋白发生了特异性结合，二者存在相互作用。fibrillarin蛋白在生物体内参与rRNA前体的加工，那么可以推测，突变体植株长势矮小，可能是由于ak6的缺失，导致fibrillarin蛋白与其无法融合，影响了rRNA的合成，使核糖体的合成发生障碍，影响细胞能量代谢，从而使植株长势矮小。但这仅是推测，结论还有待进一步考证。
试验成功构建了带有GST标签的拟南芥中fibrillarin蛋白的表达载体，在原核生物大肠杆菌中对重组蛋白进行了诱导表达，纯化后得到了fibrillarin蛋白；通过体外pulldown试验证明，拟南芥中的fibrillarin蛋白与ak6蛋白具有相互作用。
参考文献
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