目
录
1、输血前检测实验程序
2、改良低离子聚凝胺法实验操作规程
3、ABO 血型鉴定
4、Rh（D）血型鉴定
5、抗体筛选和鉴定试验
输血前检测实验程序
1、实验要求
血清和血浆都可以用于交叉实验和抗体检测，最好是血清标本，标本使用限制在 3 天内，含有肝素等抗凝标本可以用凝血酶或硫酸鱼精蛋白处理使其凝集析出血清。允许通过静脉输液口采集标本，但必须丢弃受残留静脉输液影响的 5ml标本。一般不允许使用溶血标本，对急性溶血性贫血和烧伤病人的溶血标本，在实验前后必须做溶血程度的比较。标本和输血申请单上的所有资料必须填写清楚并完全符合，否则应重抽标本。对所有用过的献血员和受血者标本必须在 1-6℃冰箱至少保存 7 天，所有实验都必须保证观察和记录同时进行，且记录和资料都必须至少保存 5 年。
2、血型检测
要求完成病人 ABO 正反定型、Rh（D）。
3、交叉试验
3.1 受血者交叉配血时所用的标本必须是输血前 3 天之内的。
3.2 配血时要逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO 血型（正、反定型），并常规检查患者 Rh（D）血型（急诊抢救患者紧急输血时 Rh（D）检查除外），正确无误时可进行交叉配血。
3.3 凡是输注全血、浓缩红细胞、红细胞悬液、洗涤红细胞、冰冻红细胞、浓缩红细胞、手工分离浓缩血小板等患者，应该进行交叉配血试验。机器单采浓缩血小板、冷沉淀、新鲜血浆应与 ABO 血型同型输注。
3.4 按《全国临床检验操作规程》要求完成凝聚胺交叉试验和检测不完全抗体的交叉试验（聚凝胺法、抗人球蛋白法） 。除紧急输血和自身输血外，所有输入红细胞的其他制品均要求做血交叉试验。
3.5 另外必须开展的试验有抗人球蛋白试验，抗体筛选实验。
改良低离子聚凝胺法实验操作规程
1、目的：减少交叉配血试验的假阳性。
2、适用范围：交叉配血、血型鉴定、抗体筛检血型血清学试验。
3、试剂来源：(台资)珠海贝索生物技术有限公司
4、采集与处理：
4.1 静脉采血 3-4ml，并观察是否溶血、乳糜血，如有此现象应再留标本并做记录。
4.2 检查留样试管、标签、标号、姓名、血型是否齐全，如有遗漏应拒收。 4.3 将血标本试管放 37℃水浴中 10 分钟，离心。
5、标准操作：
5.1 主（次）管加入受（供）血者血清 2 滴，加供（受）血者 4%红细胞盐水悬液 1 滴。
5.2 各管加 LIM0.8ml，混匀，静置 1 分钟，各管加 Polybrene Reagent 1 滴，混匀，3000转/分离心 15 秒，倒出上清液（残留约 0.1ml），轻摇，肉眼可见明显的凝集状（如无凝集须重做），加假凝集清除液 1 滴于管底，轻摇，凝集 1 分钟内消失呈均匀混悬液，为阴性，凝集 1 分钟内不能被消除，即为阳性。
5、结论：
阳性表示受（供）血者血清中含供（受）者红细胞血型 Ag 相应的 Ab（IgG、IgM），供受血者不相容，阴性表示供受血者相容。
6、注意事项：
6.1 操作者须严格按照操作说明进行试验，红细胞浓度、血清滴量、反应时间、离心速度等均可影响试验结果。
6.2 若为弱凝集结果，本试剂盒按下述试验操作方法，还可进一步提高试验灵敏度。试验操作方法如下：
6.2.1 检测管中加试验血清 2 滴，4%红细胞盐水悬液 1 滴。
6.2.2 加 LIM0.8ml，混匀，静置 1 分钟，各管加Polybrene 2 滴混匀，3000 转/分离心 15 秒，倒出上清液（残留约 01ml） ，轻摇，肉眼可见明显的凝集状（如无凝集须重做） ，加假凝集清除液 1 滴于管底，轻摇，凝集 1 分钟内消失呈均匀混悬液，为阴性，凝集1分钟内不能被消除，即为阳性。
6.3 检测标本应为非抗凝血，如标本中含抗凝成分的含量过高明显干扰凝集反应，可适当调加 Promoter 的滴量，以中和抗凝成分的干扰。
6.4 试验温度以 20-30℃为宜，若为寒冷凝集，37℃水浴5分钟，在此温下观察，
凝集消失，说明冷凝集素存在。
6.5 肉眼直观判断的结果应确保与显微镜下观察结果一致，直观不能明确判断的可疑结果须镜检，镜下：阴性结果应该是单个 RBC 均匀分布，有 RBC 凝集状散在的即为弱阳性。
6.6 试验质量检验：取自身血清与自身红细胞用本试剂盒试验方法作自身阴性对照试验，取 IgG 抗 D 血清与 RhD（+）RBC 用本试剂盒试验方法作阳性对照实验，对照实验符合，试剂有效。
6.7 疑难结果以抗人球蛋白实验（AGT）作最终判断试验，试验操作参照经典AGT（在AGT中，加入本试剂盒中的LIM0.8ml 37℃孵育时间可缩短至 10 分钟）。 6.8 本试剂盒适宜大多数血型抗体的检测，但对 kell 血型系统抗体（主要存在白种人群）检测效果较差，由于我国黄种人群中 kell 血型系统抗体阳性者罕见，因此适合在国内推广。可补充抗人球蛋白试验，以提高对 kell 血型系统抗体的检出率。
ABO 血型鉴定
1、测定原理
根据红细胞上有或无 A 抗原或／和 B 抗原，将血型分为 A 型、B 型、AB 型及O 型 4 种。可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定 ABO 血型。所谓正定型，是用已知抗—A 和抗—B 分型血清来测定红细胞上有无相应的 A 抗原或／和 B 抗原；所谓反定型，是用已知 A 细胞和 B 细胞来测定血清中有无相应的抗—A或／和抗—B。
2、标本种类及收集要求 2.1 受检者血清；
2.2 枸缘酸钠抗凝血或未稍取血，受检者血液制成 5 ％红细胞盐水悬液使用。 2.3 标本出现中度溶血者，为不合格标本，不能用于检测。
3、操作步骤 3.1、试管法
3.1.1 取洁净小试管(内径 10mm×60mm)3 支，分别标明抗—A、抗—B 和抗—A十 B，用滴管分别加抗—A、抗—B 和抗—A 十 B 分型血清各 l 滴（约 50 ul）于试管底部，再以滴管分别加入受检者 5％红细胞盐水悬液 1 滴，混和。 3.1.2 另取洁净小试管(内径 10mm×60mm)3 支，分别标明 A、B 和 O 细胞。用滴管分别加入受检者血清 l 滴于试管底部，再分别以滴管加入 A、B和O型5％试剂红细胞悬 液 l 滴，混和。
3.1.3 立即以 1000r／min 离心 3 min。
3.1.4 将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以内眼观察有无凝集(或溶血)现象。如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。 3.1.5 观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，此有助于 A、B 亚型、类 B 或 cisAB 的发现。 3.1.6 凝集强度判断标准
4+ 红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。 3+ 红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。
2+ 红细胞凝块分散成许多小块，见到游离红细胞。 1+ 肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞。
± 镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞。 MF 混合凝集外观(mixed field)是指镜下可见少数红细胞凝集，而极
大多数红细胞仍呈分散分布。
注：+为凝集；-为不凝集。
5、注意事项：
5.1 分型血清必须为批批检试剂，且在有效期内使用；质量性能符合要求。试剂开封后必须贴上开封日期、开封人标签，用毕后应放置冰箱保存，以免细菌污染。试剂开封后有效期为一周。
5.2 试剂红细胞以 3 个健康者同型新鲜红细胞混和，用生理盐水洗涤 1 次，以除却存在于血清中的抗体及可溶性抗原。或使用合格的商品诊断红细胞。试剂红细胞有效期：自制的为 15 天，商品的为试剂有效期。试剂开封后必须贴上开封日期、开封人标签，用毕后应放置冰箱保存，以免细菌污染。试剂开封后有效期为一周。
5.3 生理盐水启用后，有效期为二周。
5.4 所有试剂在开封或使用时，必须检查是否有变质；凡可疑者，必须更换新的试剂进行检测工作。
5.5 试管、滴管和玻片必须清洁干燥，防止溶血。
5.6 操作方法应按规定，一般应先加血清，然后再加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。
5.7 按理 IgM 抗-A 和抗-B 与相应红细胞的反应温度以 4℃为最强，但为了防止冷凝集现象的干扰，一般仍在室温(20—24℃)内进行试验，37℃可使反应减弱。 5.8 离心时间不宜过长或过短，速度不宜过快或过慢，以防假阳性或假阴性结果。 5.9 观察时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝固以及缗钱状排列的区别。 5.10 判断结果后应仔细核对、记录，避免笔误。 5.11 对于可能存在不完全抗原的时候，应在各反应方加入凝聚胺试剂，以检验不完全抗原的存在。
512 对于可疑结果，必须更换所用的试剂，重新检测。 5.13 5%红细胞悬液的配制：用生理盐水洗涤红细胞 3 次。 根据下表进行红细胞悬液的配制
悬液浓度（%） 压积红细胞（滴） 盐水（滴）
2 1 2ml(40) 5 1 0.8ml(16)
Rh（D）血型鉴定
1、实验原理
红细胞与抗 D 抗体发生凝集反应表明该细胞有 D 抗原，反之，无凝集现象表明试验的红细胞缺少正常强度的 D 抗原。
2、标本收集和制备
无菌操作收集血液标本,收集后尽可能立即进行实验。如果不能立即实验,应将样品贮存于 2-8℃。收集在 ACD、CPD、CPD－2A 液中的血液标本,不超过 21天仍可进行实验，但是加 EDTA、肝素和凝集的血液标本，实验应在 2 天内进行。
3、仪器、试剂、校准品、质控品、培养基、以及其他所需物品：
RhD(IgM)血型定型试剂（单克隆抗体）：上海血液生物医药有限责任公司，产品注册号：国药准字 S20060018,包装、规格：每盒内装有 1 支试剂，10ml/支，储存要求：存放 2—8℃，有效期内使用。
4、操作步骤 4.1 玻片法：
4.1.1 干净玻片上加 1 滴抗 D。
4.1.2 再加入1滴4%-5%的被检红细胞悬液。该红细胞悬液可以是盐水悬液， 也可以是悬浮于自身血浆或血清中的红细胞。
4.1.3 在圆形的玻片区域中混匀，前后缓慢摇晃玻片。2 分钟左右肉眼判读结果。不要将试剂的干燥与凝集相混淆。
4.1.4 如果是阴性，需要试管法重做一遍实验。 4.2 盐水试管法
4.2.1 加一滴抗 D 试剂于预先标记好的试管中
4.2.2 再加 1 滴约 3%—5%红细胞生理盐水悬液于试管中。混匀。 4.2.3 离心，速度和时间可选择以下二种之一： 转速 1000rpm，时间1 分钟或 3400rpm，时间 15 秒。
4.2.4 检查是否溶血（溶血可能是阳性结果，或者是细菌污染） ，然后轻轻摇晃，使细胞再悬浮起来。
4.2.5 观察凝集状况，并立即记录结果。必要时可借助显微镜。
4.2.6 若是阴性结果，需在 37℃孵育 15 分钟-30 分钟，然后再离心观察结果。 结果若呈阴性需进一步确认是否是弱 D。
5、参考值范围
阳性反应：出现红细胞凝集，为 RhD 阳性。 阴性反应：红细胞不出现凝集，为 RhD 阴性。
6、方法的局限性
本实验不能凝集CategoryDVI细胞，对于阴性和弱阳性结果，按有关安全输血规范进行确认实验，必要时送血型参比实验室进行确认。
7、注意事项
7.1 试剂含有 0.1%W/V 叠氮钠，如果摄入会中毒。
7.2 试剂如出现混浊则不能使用，若开瓶使用时间较长后，最好用已知 RhD 阴性、RhD 阳性红细胞检查结果是否符合，以防制品污染、变质失效，而造成错误。及时贴上开封时间标签，在效期内使用。
7.3 由于人红细胞的 D 抗原往往表现较弱，故必要时进行显微镜镜检，以免错判结果，特别是阴性结果时。
7.4 Rh 血型鉴定应严格控制温度与时间，因 Rh 抗原、抗体及反应凝块比较脆弱，观察反应结果时，应轻轻侧动试管，不可用力振摇。 7.5 对于结果可疑的，必须洗涤红细胞后重新检验。
抗体筛选和鉴定试验
1、原理
红细胞血型抗体分子的物理特性与血清学的反应性之间有着直接的关系。可分为 IgM和 IgG球蛋白抗体
IgM 为天然抗体，在盐水介质中能直接凝集相应的红细胞，使之发生肉眼可见的凝集反应。
IgG为免疫抗体，常经妊娠或输血等免疫产生。在盐水介质中不能凝集而只能致敏抗原的红细胞，且必须通过特定的方法使致敏红细胞发生凝集。如牛血清白蛋白、酶、抗球蛋白、凝聚胺、凝胶（或玻璃）等方法。
2、方法
待检血清需要使用多种方法进行鉴定。一般使用盐水法、酶方法、抗球蛋白法、凝聚胺法或凝胶卡法检测抗体。在检测到弱抗体时，可以利用适当增加血清的细胞比例、适当增加孵育时间、加入低离子强度溶液增效剂或 PEG 聚氧乙烯乙二醇等方法增加反应的敏感性。不同的抗体在不同的方法和条件下可以有不同的表现。这些特性为判定抗体特异性提供了参考信息。
3、试剂
3.1、红细胞：选取三个以上的 O型红细胞组成一组筛选细胞（已知抗原）。
3.2、谱细胞：选取八个以上的 O型红细胞组成一组谱细胞（已知抗原）。
4、操作
4.1、不规则抗体的筛选：用筛选细胞（
1、
2、3 号） ，同患者血清在三种介质中（盐水、凝聚胺、抗球蛋白）反应，需做自身细胞对照。
4.2、不规则抗体的鉴定：对筛选阳性的患者应检查其抗体的特异性。用一组谱细胞（1-11）同患者血清在三种介质中（盐水、凝聚胺、抗球蛋白） ，进行抗体的筛选，需做自身细胞对照。
5、结果判断
阳性反应：出现红细胞凝集。表示红细胞上有相应抗体存在。
阴性反应：出现红细胞不凝集。表示红细胞上没有相应抗体存在。
结合谱细胞反应格局，确定抗体特异性。
6、临床意义
6.1、定血型；
6.2、测效价
6.3、可能几率：正确的抗体鉴定，必须有充分的谱细胞支持。
7、标本要求
7.1、按照一般的血液样本采集步骤采集血液标本。该标本可于 4℃或 0℃以下冷冻保存三周或数年。一般不需特殊处理。
7.2、应用 EDTA 抗凝标本，可反应体内红细胞被补体致敏的真实情况。抗凝标本也用于直接抗球蛋白试验，并可提供洗脱技术所需的红细胞来源。
7.3、需要一管新鲜收集的凝固的血液标本用作血清研究。若怀疑冷抗体引起的直接抗球蛋白试验阳性，其血液标本凝固应保持在 37℃，直到血清被分离出来为止。
8、注意事项
8.1、仅用于体外诊断
8.2、试剂贮藏温度 2-8℃； 8.
3、试剂有效期两个月。
