细菌室工作守则
1.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。 2.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。
3.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。
4.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。 6.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。
7.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于3%来苏儿溶液中5-10分，再用肥皂洗手并冲洗干净；如误入口内，应立即吐出，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。、
8.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗；如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。
9.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品（如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等）必须远离火源，妥善保存。
10.工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、用具等放回原处，清理台面，未污染的废弃物扔进污物桶，有菌废弃物应送高压灭菌后处理。 11.离室前工作人员应将双手用消毒液消毒，并用肥皂和清水洗净。 12.爱护仪器设备，经常清洁，注意防尘和防潮。
细菌室消毒隔离措施
1.每天工作前用消毒液消毒工作台，上班前、下班后开紫外灯（最少半小时）进行空气消毒。
2.非必要品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 3.使用后的载玻片、盖片、平皿、试管等用消毒液浸泡，经煮沸后清洗或丢弃。 4.试验后的血液标本用消毒液浸泡后煮沸消毒，所有用于试验的反应板、吸头等用消毒液浸泡（至少24小时以上）后清洗或丢弃。
5.所有微生物培养物（细菌、支原体、真菌等培养物），不管标本阳性或阴性均
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1.工作人员必须穿工作服,戴工作帽,必要时穿隔离衣，胶鞋，戴口罩,手套。 2.使用合格的一次性检验用品,用后进行无害化处理。
3.严格执行无菌技术操作规程,静脉采血必须一人一针一管一巾一带;微量采血应做到一人一针一管一片;对每位病人操作前洗手或手消毒。
4.无菌物品如棉签,棉球,纱布等及其容器应在有效期内使用,开启后使用时间不得超过24小时.使用后的废弃物品,应及时进行无害化处理,不得随意丢弃。 5.各种器具应及时消毒,清洗;各种废弃标本应分类处理(焚烧,入污水池,消毒或灭菌)。
6.报告单应消毒后发放。
7.检验人员结束操作后应及时洗手,毛巾专用,每天消毒。
8.保持室内清洁卫生.每天对空气,各种物表及地面进行常规消毒.在进行各种检验时,应避免污染;在进行特殊传染病检验后,应及时进行消毒,遇有场地,工作服或体表污染时应及时处理,防止扩散,并视污染情况向上级报告。 9.菌种、毒种按《传染病防治法》进行管理。
10.实验室的医院感染管理参照检验科的管理要求.实验动物应严格管理,防止逃逸或造成人与实验室动物的交叉感染;实验后的动物必须焚化进行无害化处理。
细菌室操作
1.细菌鉴定和药敏试验操作按全国临床检验操作规程。
2.负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。
3.从事细菌专业技术人员，应了解医院监测知识，掌握其检测方法，定期统计分析医院感染细菌分布，耐药变迁，并将其结果反馈临床。 4.细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌知识。 5.细菌专业人员不断更新知识，了解细菌学检验新进展。
6.定期或随时与临床联系，主动参与病例讨论了解病情及治疗情况，达到细菌检验与临床的密切联系。
7.每天发出的微生物报告应认真复审，分析报告、评价报告。 8.工作人员加强有菌观念，无菌操作。 9.当工作环境被细菌污染，必须立即消毒处理，报告主管人员，采取必要措施。 10.工作人员被细菌培养物污染应消毒处理，必要时给予药物治疗，并向主管负责人报告，采取特殊措施。
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标本拒收标准
1.支原体培养、鉴定、计数、药敏操作：若送检标本不是运送培养基送检则为不合格标本。
2.找抗酸杆菌：穿刺液标本如发现严重凝固则拒收。 3.脑脊液培养：如标本为非无菌管采集则拒收。 4.中段尿培养：如标本为非无菌管采集则拒收。 5.下呼吸道标本培养：挑取痰标本直接涂片镜检，WBC＜10/LP，上皮细胞＞25/LP不适合做细菌培养。
6.脓液及创伤分泌物培养：如标本为非无菌管采集则拒收。 7.穿刺液培养：如标本为非无菌管采集则拒收。
8.各类培养标本原则上都要求无菌采集并及时送检、及时接种、及时培养，不能保存。除非特殊情况可置于冰箱保存，对分离怕冷的细菌时，应注意标本的保暖。
无菌间规章制度
1.2.3.4.5. 每一个工作人员必须树立无菌观念，严格进行无菌操作。 在无菌室内必须戴帽子、口罩，进行无菌操作。
每天早上8：00—8：30用紫外线消毒，每月检查一次紫外灯的无菌效果。 无菌室内各种废弃物品必须煮沸消毒。
实验完毕后，用含氯制剂1000mg/L消毒桌面、地面。
温度失控处理措施
1.每天上班记录培养箱、冰箱的温度于温度记录本上，如发现普通培养箱的温度超过37℃（不包括37℃）或低于34℃（不包括34℃）；冷藏冰箱的温度超过8℃（不包括8℃）或低于2℃（不包括2℃），应立即追溯其失控的时间和原因。 1.1如失控的原因可以马上纠正（如冰箱断电、冰箱门未关好、温控调节器未正确控制、冰箱严重结霜、温度计损坏等），则由本室人员马上纠正并填写失控报告。
1.2如冰箱、培养箱本身出现机械故障，本室人员应马上通知维修部或维修商，同时根据排除故障时间的长短是否会对其中的物品质量造成影响而采取相应的措施（如把里面的物品转移到能满足需要条件的环境中），并填写失控报告单。
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标本的接种和移种法
接种标本是细菌实验室的一项基本操作技能，目的是使细菌能得到充分的生长和能分离出单个菌落获得纯培养而供分析鉴定之用，所以作此项技术的操作应按以下方式进行：
1.左手的操作要点：左手负责持平板、试管、烧瓶等物品，操作中，左手应尽量减少摆动，否则，不利于保持物品的无菌状态。
1.1左手持物品时，最好固定在一个空间方位上，以避免因移动使空气中的细菌进入器皿，造成随机性污染。
1.2所持的器皿其开口尽量避免向上，持平皿时，可以让平板的表面与地面尽量垂直，试管与器皿烧瓶也可倾斜。当从标本器皿或平板上挑取接种物或菌落后应立即塞上试管塞或扣上平皿，随即接种标本。
2.右手的操作要点：握有接种工具的右手，将接种环或针沿伸到标本之前应作好接种环或针，镊子等工具的火焰消毒工作，待冷却后才沿伸到标本容器中挑取接种物，在挑取标本后，其接种工具应尽量避免接触试管壁及试管口等。随后将接种物在培养基上分离划线。
3.移种或接种的基本步骤：
3.1右手持接种工具，在火焰上烧灼3次灭菌。
3.2左手持起标本容器或原代培养物的平皿或试管等。
3.3用接种工具挑取适量标本或细菌，挑取标本时，应注意选择真实反映感染情况的部分，如粪便挑取粘液脓血部分。纯化细菌应从原代培养物上挑取单个菌落。从液体培养基中取菌，只需将接种环在培养液中蘸取一环即可。 3.4接种时可根据要求采用不同的接种方法。
3.5接种后，应在火焰上反复烧灼接种工具并作一定的编号记录，所用工具应放回原处。
常用分离培养基
1.常用分离培养基种类：血平板、巧克力平板、麦康凯平板、SS平板、克氏双糖铁（KIA）、M-H培养基、营养琼脂平板、沙保氏培养基、4号培养基、念珠菌药敏平板。 2.用途：
2.1血平板适用各类细菌生长，为一般细菌标本接种常用培养基。
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离划线。其他标本做分区划线。
3.所接种的平板必须写上标本的编号和接种的日期，然后根据要求进行培养。 4.标本的培养条件、温度、时间
平板
温度
时间 血平板
35-37℃
18-24小时 沙保罗平板
28-31℃
24-36小时
其他的平板
35-37℃
18-24小时
5.根据生长在平板上的细菌菌落形态、菌落涂片、染色、镜检等来综合判断细菌形态和染色性质，按各属鉴定的作业指导书进行各菌属的常规鉴定及药敏试验。 6.结果的报告
确认细菌鉴定及药敏试验结果后，进行检验验单结果报告。
7.对各类细菌培养标本除特殊要求外，我室细菌标本在接种后每天按要求进行无害化处理。
分离及纯化法
1.分离是指从原材料或多种细菌的混合培养物中将各种细菌彼此独立地分离开，以得到纯的单一菌株，技术步骤如下：
作纯培养分离时，一般只用一只完整的琼脂平板。涂划多采用分区划线法，在一只平板中可划3～5个区。划法有两种：
显微镜检查是细菌鉴定工作中的一重要手段，有助于细菌的初步鉴别，同时对下一步鉴定工作起着重要的指导作用。有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。
1.不染色标本的检查：不染色标本主要用于检查细菌的动力及运动状况。 1.1压滴法：用接种环取细菌悬液2环，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。
1.2悬滴法：取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各1块，将凹孔四周的平面上涂上一层凡士林，取一环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。镜下观察时先低倍后高倍，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野显微镜观察其形态、活动。
2.染色标本检查法：通过对标本的制片及染色，能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性以及荚膜、芽胞、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步鉴定。 2.1快速革兰染色法
2.1.1操作见《全国临床检验操作规程》第二版 微生物学检验 2.1.2结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
2.1.3注意事项：染色关健在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度，菌龄为18～24小时为佳。 2.2抗酸染色法
2.2.1操作见《全国临床检验操作规程》第二版 微生物学检验 2.2.2结果：抗酸杆菌呈红色。
2.2.3注意事项：每一张玻片只能涂一份标本且不能在染色缸中染色，以免造成不同标本间的交互污染从而导致阴阳性结果混淆，脱色时间宁长勿短，至无红色液体流下为止。
2.3阿尔培异染颗粒染色法：
2.3.1初染：涂片上滴加第一液染剂（甲苯胺蓝和孔雀绿的乙醇溶液），染3-5分钟，水洗。
2.3.2复染：第二液染剂（碘化钾溶液）染1分钟，水洗。自然干燥后镜检。 2.3.3结果：菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。
2.3.4注意事项：玻片要清洁，染料需新鲜配制，无沉淀物。注意与标本中的其他杂质相区别。
3.压片镜检，主要观察细菌在组织中的分布。
4.墨汁负染镜检：背景着色而菌体不着色的染色法，用以观察新型隐球菌的宽厚荚膜等。
5.鞭毛染色镜检，观察细菌有否鞭毛、鞭毛的位置、鞭毛的数量，在非发酵菌的
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胆汁标本的细菌学检验
1.胆汁培养常见病原菌
肠球菌
大肠埃希菌
消化链球菌
肺炎克雷伯氏菌 葡萄球菌
变形杆菌 产气肠杆菌 铜绿假单胞菌 伤寒及其它沙门菌 拟杆菌
粪产硷杆菌
2.标本收集
胆汁标本的采集方法有三种，即十二指肠引流法，胆囊穿刺法及手术直接采取法。 2.1十二指肠引流法：在无菌操作下用导管作十二指肠引流胆汁，分为A、B、C三部分。A液来自胆管，为橙黄或金黄；B液来自胆囊，为棕黄绿色；C液来自肝胆道，为柠檬色。一般认为B液做细菌培养意义较大。
2.2胆囊穿刺法：进行胆囊造影时同时采取胆汁。本法所采取的胆汁不易被污染，适宜做细菌培养。
2.3手术采取法：在进行胆部外科手术时直接采取胆汁送检。
3.检验步骤
3.1将送检标本3000r/min离心30分钟，倾去上清液取沉淀物涂片及培养。 3.2胆汁一般不作涂片检验，如需要应用相应的染色方法检查并仔细观察，因为胆汁沉淀后有较多的内容物复盖而不利于观察细菌。
3.3培养提倡直接将胆汁注入血培养瓶进行增菌培养。培养标本也可直接种血平板、麦康凯平板和巧克力平板。 4.报告结果
4.1沙门氏菌感染在胆汁中检出率较高，但必须以血清凝集试验为依据报告血清型。
4.2胆汁应是无菌的，如培养出细菌即为致病菌应报细菌的种属及药敏试验结果。
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较大、菌落中间为灰黑色、有光泽、隆起、湿润的菌落，如泼水状。挑取可疑菌落5～10个与霍乱多价“O”诊断血清作玻片凝集试验，如为阳性，则立即报告，并将可疑菌送成都市疾病控制中心确认。 3.6厌氧性难辨梭菌的培养参照厌氧培养。
3.7真菌培养：真菌性腹泻多继发于抗生素治疗后，常见的真菌腹泻多由白色假丝酵母菌引起。将标本接种于沙氏平板及血平板上，置27℃和35℃培养18～24h，根据形态染色、菌落特征，并做药敏试验。
4.报告结果：查出肠道致病菌，报告其菌名和药敏结果。如为致病性大肠埃希菌必须以血清学诊断试验为鉴定依据。
5.粪便中培养出霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌时应作为危急值报告，并填写几危急值报告单。
血液及骨髓标本的细菌学检验
1.血液及骨髓标本中常见病原菌
肺炎链球菌
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
伤寒及其它沙门菌 表皮葡萄球菌
变形杆菌
溶血性链球菌
产气肠杆菌 粪肠球菌
肺炎克雷伯氏菌 铜绿假单胞菌 粪产硷杆菌 沙雷氏菌
流感嗜血杆菌 布鲁氏菌
2.标本采集
2.1采血时间：在病人发热初期1-2天内或发热高峰时采集血液标本。采血时间原则上应选择在抗菌药物应用前,对已用药而又不能中止用药的病人，应在下次用药前采集。
2.2标本采集方法及标本量
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查：取脑脊液的离心沉淀物（3000r/min,30min）作抗酸染色。新型隐球菌涂片检查：取脑脊液的离心沉淀物作墨汁负染色。
3.2分离培养 用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物，分别接种于血平板、巧克力平板，巧克力平板应置于CO2环境中35℃培养18～24小时。脑脊液也可直接注入血培养瓶放入BacT/Alert 120或BACTEC 9050中进行监测。 4.报告结果：检出细菌，应报告菌名和药敏结果，血培养仪培养6天仍无生长者则报告阴性。
尿液的细菌学检验
1.尿液培养常见病原菌
金黄色葡萄球菌
淋病奈瑟菌 肠球菌
大肠埃希菌 A群链球菌
变形杆菌
腐生葡萄球菌
肺炎克雷伯菌 表皮葡萄球菌
产气肠杆菌 结核分支杆菌
沙门菌种
铜绿假单胞菌 沙雷菌
2.标本收集：
2.1尿液标本的采集可采用多种方法：有中段尿采集法、膀胱穿刺法、肾盂尿采集法，而常规是取中段尿作细菌培养。
2.2取中段尿作培养时先要进行前尿道的清洗消毒，以免前尿道寄生菌群污染标本。
2.3如采用其他方法收集标本，必须由临床医生根据临床诊断需要而执行收集术，并在检验单上写明。 3.检验步骤: 3.1涂片检查
3.1.1一般细菌及淋病奈瑟菌涂片：以无菌操作吸取尿液10ml，3000r/min离心15min，去上清液，取沉淀涂片，革兰氏染色镜检，作初步报告。如查见革兰氏
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结核分枝杆菌
产碱杆菌 放线菌 奴卡菌
弧菌属细菌 念珠菌
气单胞菌
2.标本采集：标本由临床医师行无菌操作术采集，但应注意以下几点：
2.1闭锁性脓肿 疑为厌氧菌感染时，取材后立即将空气排空，同时针尖插入橡皮塞内防止空气进入，连同注射器一并送检。
2.2开放脓肿、脓性分泌物可在患部直接用棉拭或纱布擦抹，如为瘘管亦可在无菌操作下取组织碎片分散在无菌盐水中。
2.3烧伤创面的分泌物，用灭菌棉拭取多部位创面的脓液或分泌物，置无菌试管中送检。
2.4取尿道分泌物必须先清洗、消毒尿道后用挤压法使分泌物从尿道溢出用无菌生理盐水浸湿拭子直接采集标本。如女性做宫颈分泌物细菌培养，应尽量避免杂菌污染。
2.5组织脏器碎片的收集，先要消毒表面的污染菌，后用无菌刀切开，取内容物及碎片分散于无菌生理盐水中，然后增菌、接种，如活体微量标本可直接放人肉汤增菌培养基中增菌。 3.检验步骤
3.1涂片检查：脓汁及分泌物标本均应做涂片检查。涂片做革兰氏染色镜检，根据形态和染色特点，可报告“找到革兰氏×性菌，形似××菌”或报告“未发现细菌”。涂片检查包括涂片找细菌、淋球菌、酵母菌等。 3.2培养
普通细菌培养：标本接种血平板、巧克力平板和麦康凯平板各一只，35℃培养18～24小时，根据菌落特性和形态染色，选择相应的鉴定及药敏卡上VITEK全自动细菌分析仪进行鉴定和药敏试验，如培养48小时无菌生长，即报告“无菌生长”。 4.报告结果
4.1涂片报告发现革兰氏×性××菌，淋球菌要报告在白细胞内外是否发现革兰氏阴性双球菌。
4.2对正常无菌部位的感染，从脓汁或分泌物分离到细菌，均有临床意义，按分离鉴定结果报告细菌名称及药敏试验。
下呼吸道标本的细菌学检验
1.下呼吸道标本培养常见病原菌
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5.耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌为MRSA，耐苯唑西林的凝固酶阴性葡萄球菌为MRSCN。
临床意义：葡萄球菌是人类化脓性感染中最重要的病原菌，能引起多组织、多系统的化脓性感染，另外还可引起脑膜炎、败血症等
链球菌属的常规鉴定
1.取平板上的菌落直接涂片、革兰染色并镜检，链球菌为革兰阳性球菌，单个、成双或链状排列。无芽胞，无鞭毛。肺炎链球菌为革兰阳性双球菌，呈矛头状，宽端相对，尖端向外，成双排列，有荚膜。
2.最适生长温度为35～37℃，在5％CO2环境下生长更好。链球菌在液体培养基中生长时表现为絮状或颗粒状沉淀，易形成长链。在血平板上生长18～24h后可形成直径为0.5～2mm的圆形突起菌落和环绕菌落形成的三种特征性溶血现象：①甲型（α）溶血：即草绿色链球菌；②乙型（β）溶血：即乙型溶血性链球菌，③丙型（γ）溶血：即不溶血链球菌。
3.分离培养常采用羊血平板和巧克力平板，置于5％～10％的CO2环境下培养。 4.触酶试验（3%过氧化氢试验）：阴性
5.杆菌肽敏感试验阳性、胆汁溶菌阴性、CAMP试验阴性可初步鉴定为A群链球菌（化脓性链球菌）。 6.CAMP试验阳性、马尿酸钠试验阳性、β溶血可初步鉴定为B群链球菌（无乳链球菌）。 7.Optochin敏感试验阳性、胆盐溶菌和荚膜肿胀试验阳性，可初步鉴定为肺炎链球菌。
8.胆盐溶菌试验：肺炎链球菌产生自溶。
临床意义：A群链球菌（化脓性链球菌）临床上常引起痈、蜂窝织炎、急性咽炎、丹毒，脓疱疮、猩红热、医源性伤口感染和产后感染等，此外，化脓性链球菌感染后也可发生急、慢性风爆湿热和急性肾小球肾炎等严重变态反应性并发症。肺炎链球菌为口腔和鼻咽部正常菌群，一般不致病，当机体抵抗力下降时，如在寒冷刺激、感冒和麻疹后，可引起大叶性肺炎或支气管肺炎，还可引起化脓性脑膜炎、中耳炎、乳突炎、鼻窦炎、脑脓肿及菌血症和心内膜炎等。近年来耐青霉素的肺炎链球菌及多重耐药菌株的增加，给临床治疗带来一定困难。星座链球菌广泛分布一外部环境，以及人和动物人体表、口鼻腔和肠道，也是化脓性链球菌之一，可引起心内膜炎、肺炎、菌血症、腹腔或皮肤感染。
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亚胺培南；β-内酰氨酶阴性者用红霉素、氯霉素、头孢菌素、环丙沙星。 临床意义：卡他布兰汉菌是人类和其他动物上呼吸道的正常寄生菌之一，现已证实本菌可引起下呼吸道感染和结膜炎、中耳炎、鼻窦炎、支气管炎，偶尔引起菌血症、心内膜炎、脓胸、脑膜炎、尿道炎等。
棒状杆菌属的常规鉴定
1.取平板上的菌落直接涂片，革兰染色并镜检。
2.镜下见革兰阳性杆菌，菌体一端或两端膨大呈棒状，排列不规则，常呈X、V、L、Y或栅状等多形性，菌体一端或两端可见浓染颗粒（异染颗粒）。 3.触酶：阳性；硝酸盐还原试验：阳性；分解葡萄糖、麦芽糖；蔗糖、尿素酶：阴性。
4.动力阴性；无芽孢。
5.调配0.5麦氏浊度单位菌悬液，用作药敏试验。
7.35℃培养18～24小时后，报告细菌鉴定及药敏结果。
临床意义：白喉棒状杆菌是白喉的病原菌，该菌侵犯口咽、鼻咽等部位，局部形成灰白色假膜。一般不进入血液，产生的外毒素可损害心肌和神经系统，病死率高。本菌还可侵犯眼结膜、外耳道、阴道和皮肤伤口等。
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