冬虫夏草产多糖菌株的筛选鉴定及多糖提取
摘要：为了得到多糖收率较高的冬虫夏草菌株，从西藏那曲地五高山草甸中采集的新鲜冬虫夏草子实体初步分离得到50株菌株，并对其进行形态观察和18S rDNA-ITS序列分析鉴定，采用超声辅助热水浸提法进行冬虫夏草多糖的提取。结果表明，CC-3菌株Cladosporium sp.的模式菌株JN084020的18S rDNA-ITS同源相似性为100%，初步确定为冬虫夏草的无性型，经过超声辅助热水浸提后多糖收率最高为6.619%。
关键词：冬虫夏草；真菌；筛选；rDNA-ITS序列；Cladosporium sp.
中图分类号： S182 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0240-03
冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是中国传统的名贵中药材，系麦角菌科虫草属真菌寄生于蝙蝠蛾的幼虫所形成的的菌虫复合体[1]。2001年统计，全球冬虫夏草种类已有400种，其中中国记载有105种左右[2]。
冬虫夏草在中国传统医学里已经流传1 300多年，最早记载冬虫夏草的文献始于唐朝前期公元710年的《月王药诊》，记载冬虫夏草能治疗肺部疾病。公元780年《藏本草》记载的冬虫夏草具有润肺、补肾的作用；1765年，赵学敏在《本草纲目拾遗》中记载冬虫夏草的作用是润肺、补肾、益精气，理诸虚百损；1757年，吴仪洛所著《本草从新》中指出冬虫夏草保肺益肾，止血化痰。其后，《黔囊》《文房肆考》《四川通志》《本草图说》等100多部古书都记载了冬虫夏草名贵药材[3]。
目前，研究证实冬虫夏草有降血糖、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗纤维化、抗炎等功效，对肺脏、肾脏、中枢神经系统、免疫系统、心脏、肝脏等均有较好的临床保护作用[4]。由于冬虫夏草的生长环境及人们过于采挖，冬虫夏草已经远远不能满足医疗的需求，人们开始研究冬虫夏草成分与功能的关系，冬虫夏草多糖作为冬虫夏草的重要活性成分，具有抗疲劳、抗衰老、提高免疫力的作用[5-6]。表明冬虫夏草多糖在新药开发方面有广阔的前景。
已报道的冬虫夏草的无性型菌株涉及13个属，22个种名[7]，包括细脚拟青霉（Paecilomyces tenuipes）、虫草蚧霉属（Lecanicilliuum sp.）、轮枝孢属（Verticillium sp.）、被毛孢属（Hirsutella）、头孢属（Cephalosporium sp.）等，其中部分冬虫夏草的无性型还有待进一步确定[8]。冬虫夏草的无性型研究已成为研究热点。
本研究分离筛选了50株能够产多糖的菌株，分子生物学鉴定分别为虫草蚧霉属、枝孢菌属、黑粉菌属。超声辅助热水浸提法提取冬虫夏草多糖，CC-3菌株的多糖得率最高为6.619%。研究结果为应用发酵方法生产冬虫夏草多糖替代冬虫夏草应用于医疗，以及进一步确定冬虫夏草多糖的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
新鲜冬虫夏草采自西藏那曲地五高山草甸。
1.2 培养基及试剂
PDA加富培养基：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母膏 1 g/L、蛋白胨1 g/L、KH2PO4 1g /L、琼脂240 g/L、MgSO4 0.5 g/L、蚕蛹粉1 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。
种子瓶液体培养基：KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。
发酵培养基：葡萄糖9 g/L、麦芽糖19 g/L、蛋白胨 10 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4 1 g/L、MnSO4 0.5 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。
CTAB提取液：NaCl 1.4 mol/L、EDTA 20 mmol/L、CTAB 20 g/L、Tris-Cl 100 mmol/L、巯基乙醇2 g/L、pH值8.0。
苯酚 ∶氯仿 ∶异戊醇溶液=25 ∶24 ∶1。
RNA酶：1 mg/mL。
真菌通用引物：ITS1和ITS4。
1.3 试验方法
1.3.1 冬虫夏草菌株的分离纯化
无菌条件下将新鲜的冬虫夏草用1%HgCl2溶液消毒，用无菌水冲洗干净，并用无菌的滤纸吸干表面的水分，分离冬虫夏草的蛹体和子座部分，分别研磨成粉，用无菌湿棉签蘸取粉末涂于加入氯霉素1 g/L 的PDA加富平板上，倒置于28 ℃培养箱中培养至单菌落出现。挑选菌丝色泽洁白、生长健壮、无杂菌污染的菌株，转接加入氯霉素1 g/L 的PDA加富试管斜面中，28 ℃培养箱中培养7～10 d，直至整个斜面都长满菌丝，选取生长健壮，无杂菌的菌株即为分离得到的菌株。
1.3.2 菌种的鉴定
1.3.2.1 菌体形态观察
将分离得到的菌株梯度划线接种于PDA平板中，用无菌镊子取无菌盖玻片，斜插入培养基中，每天观察并记录菌落生长情况，7 d后，拔出插片，显微镜下观察菌丝形态及产孢形式。
1.3.2.2 菌株的ITS序列测定
（1）基因组DNA的提取。采用CTAB法[9]提取基因组DNA。
（2）ITS序列分析。
ITS序列引物为真菌通用引物，ITS1和ITS4[10]。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；
ITS4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
PCR扩增反应体系（25 μL）：DNA 2 μL、TaqDNA聚合酶0.3 μL、10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5 μL、ITS1 2 μL、ITS4 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 14.2 μL。
PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。
（3）琼脂糖凝胶电泳及测序。
PCR产物扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，条带清晰，用蛋白核酸测定仪测定后无蛋白和核酸残留，送北京宝锐通生物技术有限公司测序。
（4）ITS测序数据分析。
在NCBI中对菌株的ITS序列进行BLAST分析，然后用MEGA5进行系统发育树的构建。
1.3.3 提取冬虫夏草多糖
1.3.3.1 冬虫夏草菌丝体的制备
在无菌条件下挖取1 cm2的分离菌株的培养菌苔接种于装有100 mL种子培养基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃摇床培养7 d。
按10%的接种量，接种于装有100 mL发酵培养基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃摇床培养7 d。
发酵液 8 000 r/min 离心10 min。收菌丝体、80 ℃烘干、粉碎、过80目筛，备用。
将烘干的冬虫夏草菌丝体粉碎，过40目筛，备用。
1.3.3.2 超声辅助热水浸提法提取冬虫夏草多糖
取干燥恒重的冬虫夏草菌丝粉10 g，提取溶液为去离子水（首次加量料液比为1 g ∶20 mL，浸泡30 min之后，加水量料液比按前加量的75%递减）。提取条件：温度90 ℃、提取4次、每次浸提时间90 min，超声功率150 W。
1.3.4 冬虫夏草多糖含量测定
采用苯酚-硫酸比色法[11-12]测定。
1.3.4.1 绘制葡萄糖标准曲线
取烘干至恒重的葡萄糖标准品配置成最终浓度为0.1 mg/mL的标准液，取9支试管分别取葡萄糖标准液0.1、0.
2、0.3、0.
4、0.5、0.
6、0.7、0.8 mL，各补加蒸馏水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置10 min。于40 ℃水浴中加热 30 min，以蒸馏水替代葡萄糖标准液为空白对照，于D490 nm波长处测吸光度。
1.3.4.2 冬虫夏草多糖含量的测定
取冬虫夏草多糖提取滤液，稀释一定的倍数，取1 mL稀释液，加入5%苯酚溶液 1 mL，摇匀、迅速加入5mL浓硫酸，摇匀、静置10 min。于 40 ℃ 水浴中加热30 min，以蒸馏水作空白对照，在D490 nm处测定吸光度。按回归方程计算稀释液多糖含量。按下式计算多糖含量：多糖含量（mg/g）=待测液中多糖浓度（mg/mL）×溶液体积（mL）×稀释倍数/原料质量（g）。
2 结果与分析
2.1 冬虫夏草菌株的分离纯化
对分离出的50株生长健壮、无杂菌、菌丝洁白的菌株进行多糖的提取，并测定多糖含量，根据葡萄糖标准曲线得到的回归方程，计算虫草多糖得率。回归方程为y=10.399x-0019 5，r=0.998 7。根据计算得到，CC-3菌株的多糖得率最高，达6.619%。不同菌株的多糖含量结果见表1。
3 讨论与结论
冬虫夏草的生活史分为有性型的子囊孢子阶段和无性型的分生孢子阶段。而人工培养、液体发酵菌丝体的冬虫夏草均为无性型阶段，因此，冬虫夏草无性型及菌种的鉴定至关重要。
最早人们判定冬虫夏草有性型和无性型的关系，依据假定无性型与虫草有性型子实体有相关性，用人工诱导虫草子实体的形成。人工诱导方法在人工诱发子实体长出子囊孢子非常困难，培养出的虫草子实体寥寥无几，人工诱导方法只能为虫草有性型和无性型的鉴定提供依据。
刘作易等从云南收集的新鲜冬虫夏草（Cordyceps sinensis），利用微循环对其子囊孢子的产孢结构进行了观察，并与组织和子囊孢子分离的菌株的产孢结构进行比对，还与中国被毛孢（Hirsutella sinensis）的产孢结构进行比较。结果显示微循环的产孢结构与分离菌株和中国被毛孢的产孢结构相似，由此确定冬虫夏草的无性型为中国被毛孢[13]。该方法虽操作简单，但必须要先明确此菌株的种属关系，该方法在冬虫夏草无性型的鉴定上也还是一种辅助手段。
随着分子生物学的发展，RAPD-PCR技术为确定虫草的无性型提供了可靠的分子生物学证据，但该方法不能很好地确定菌株的种和亚种。ITS序列分析的发展，为菌株无性型与有性型关系及菌株的近缘关系方面提供了可靠证据。Kang等报道，甘肃虫草和冬虫夏草具有相同的 ITS序列，并认为甘肃虫草可能是冬虫夏草的分类异名[14]。张泽文对古尼拟青霉菌种的完整的 rDNA的ITS 区进行序列测定并进行比对，结果表明，分离到菌种为古尼虫草的无性型，即古尼拟青霉（Paecilomyces gunnii）[15]。
本研究从采摘的新鲜冬虫夏草子实体中分离得到CC-3菌株，运用插片法对该菌株的菌丝形态和孢子结构进行显微观察，初步判断菌株的菌属关系，通过RAPD-PCR技术，用通用引物ITS1 和ITS4扩增出18S rDNA片段，进行序列比对，最后确定该菌株的种属关系。
多糖提取方法很多，如水提醇沉方法提取多糖，在醇沉过程中会损失大量多糖；酶解法提取多糖，条件温和、质量好，但是经济价值高；热水浸提法提取多糖，方法简单易行，但效率较低。超声波产生的强烈振动和空化效应，使细胞破碎程度增大，加速了多糖的溶出，有利于多糖的提取。本试验采取超声波辅助热水浸提法提取虫草多糖。
多糖测定方法也很多，通常采用硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法测定多糖的含量。硫酸-蒽酮法由于糖与蒽酮试剂的显色深度不同，糖混合时，常因不同糖类比例造成一定的误差。而苯酚-硫酸法测定多糖，方法简单、灵敏度高、不受蛋白质存在的影响，产生的颜色稳定。
从西藏新鲜的冬虫夏草中初步分离得到50株菌株，经过多糖含量测定，CC-3菌株多糖得率最高，为6.619%，多糖含量高达6.619 mg/g。对CC-3菌株进行形态学观察、分子生物学18S rDNA序列分析，初步鉴定CC-3菌株为Cladosporium sp.菌株。
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