【摘要】：目的构建脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NspA基因重组子,实现其在大肠杆菌的高效表达。方法提取脑膜炎奈瑟菌标准株基因组DNA,PCR扩增NspA基因,插入表达质粒载体pET-30c中,构建pET-NspA重组子,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白,镍琼脂糖凝胶纯化NspA融合蛋白。结果获得了脑膜炎奈瑟菌NspA基因的表达重组子,得到NspA诱导表达蛋白并进行了初步纯化 【关键词】： 脑膜炎奈瑟菌 外膜蛋白NspA 蛋白质表达 融合蛋白 大肠杆菌 重组子 琼脂糖凝胶电泳 高效表达
Abstract: The goal construction meningitis nai Chinese zither fungus external coat periplast protein NspA gene recombination, realizes it at backwoods coli\'s highly effective expreion.Method extraction meningitis nai Chinese zither fungus standard genome team DNA, PCR increases the NspA gene, the insertion exprees in material particle carrier pET-30c, constructs the pET-NspA reorganization, the transformation backwoods coli BL21(DE3), the isopropyl groupsulfo- galactose glucoside (IPTG) induction reorganization protein exprees, SDS-PAGE and Western the blot examination exprees the protein, the nickel agarose gelatin purifies the NspA fusion protein The result has obtained meningitis nai Chinese zither fungus NspA gene expreion reorganization, was under the NspA induction to expre the protein and to carry on the preliminary purification.The conclusion succe has constructed meningitis nai Chinese zither fungus NspA gene expreion reorganization, has realized this gene in backwoods coli highly effective expreion, to study this protein the immunology performance, the preparation immune body and the development prevention meningitis\'s vaccine has laid the foundation.
Key word: Meningitis nai Chinese zither fungus external coat periplast protein NspA protein expreion fusion protein backwoods coli reorganizes the sub-agarose gel electrophoresis highly effective expreion
前言
脑膜炎奈瑟菌（neieria meningitidis）主要引起流行性脑脊髓膜炎，至于脑膜炎奈瑟菌肺炎，有不少人认为是继发于脑膜炎奈瑟菌败血症的一种少见的化脓性迁徙合并症。实际上，1907年首次报告后，已有许多资料表明脑膜炎奈瑟菌可作为原发性下呼吸道感染的致病菌，引起原发性脑膜炎奈瑟菌肺炎。该菌又称脑膜炎双球菌，为需氧革兰阴性球菌，普通培养基上不生长，选择性培养基利于痰标本中脑膜炎奈瑟菌的分离和鉴定。根据菌体荚膜层的多糖，目前至少可分13种血清型。其中A、B、C、X、Y、Z和W-135型在临床上日趋重要。据统计资料分析，过去十余年中在普通人群及医院内人群中，引起呼吸系统感染的血清型为Y型和W-135型，其传播途径主要通过飞沫直接从空气传播，呼吸道感染了流感病毒或腺病毒的人群更具有易感性。其病理改变为渗出化脓性炎症，沿肺泡或支气管肺泡分布，个别呈大叶浸润甚至肺组织坏死和脓肿形成。
脑膜炎奈瑟菌所致呼吸系疾病是在本世纪被认识的，尤其是在1918~1919年流感流行期间，脑膜炎奈瑟菌是重要的呼吸道病原菌。此后，由脑膜炎奈瑟菌一起的肺炎很少有报道。直至70年代，随着细菌检测技术的进步，有关脑膜炎奈瑟菌肺炎的报道才不断增多，如Y型脑膜炎奈瑟菌肺炎曾在某军事基地有过暴发流行。
流行性脑脊髓炎是一种常见的病死率较高的急性传染病，由脑膜炎奈瑟菌引起，该病原体已发现有十三个血清型，其中的B型脑膜炎奈瑟菌是近年发现较多的病原体【1】。现有针对该病预防性疫苗的主要成分为脑膜炎奈瑟菌的荚膜多糖，对A,C,Y和W-135等亚型可以产生有效的预防作用，但对B型脑膜炎奈瑟菌预防效果不甚理想，而且可能一起严重的自身免疫反应，所以不少学者转而研究其他膜抗原，如研究较多的外膜颗粒（OMVs）,但其预防作用仅限于特异的少数菌株，对小年龄组儿童也缺乏足够的免疫原性和保护性【2】，不能作为理想疫苗，于是有学者开始研究脑膜炎奈瑟菌的其他膜成分，如PorA、LPS、脑膜炎奈瑟菌表面蛋白A（NspA）、Nada等。其中的NspA抗原性高度保守，分布于所有已知脑膜炎奈瑟菌表面，不少学者对其进行了研究，如用春花的NspA【3】，包含NspA的OMVs颗粒【4】，PorA、OpaB和NspA的肽段混合物来免疫动物，均可长生针对B型脑膜炎奈瑟菌的免疫保护作用；有资料证明NspA在动物体内不但可诱导产生抗体，而且相应抗体对实验中各种致病性脑膜炎奈瑟菌均具有杀灭作用【5】。这提示NspA是最有潜力的疫苗成分之一，将NspA用于疫苗，有可能预防各种血清型脑膜炎的发生，但有关这方面的研究国内尚未见相关报道。
我国1980年正式使用A群多糖菌苗，临床观察表明对学龄儿童和成人保护率可达90%。但此种疫苗对2岁以下婴幼儿免疫原性差，其一是因为脑膜炎荚膜多糖抗原属于T细胞非依赖抗原，免疫效果与接种者年龄有明显的依赖关系；其二，多糖菌苗诱导机体产生的IgG抗体主要为IgG2亚类，出现较迟，一般到8～12岁才能上升至成人水平。因此，婴幼儿接种多糖菌苗后往往以产生短暂的IgM抗体为主。国外采用A群和C群多糖与白喉毒素蛋白偶联的偶联菌苗接种8～10周龄的婴儿，证明这种偶联菌苗具有良好的免疫原性及安全性。
目前对脑膜炎奈瑟菌的预防和疫苗预防，药物和疫苗预防对于降低流行性脑脊髓膜炎发病率，控制流行性脑脊髓膜炎的流行时安全和有效的，已起到十分重要的作用。如对带菌者或易感人群，可用青霉素、利
福平、米诺环素进行药物预防，或应用含有A、C、Y、W-135血清型的四价疫苗接种进行免疫预防。但药物和疫苗预防能否保护易感人群预防呼吸系统的原发感染，目前尚无这方面的资料，尚待观察研究。
本实验采用pET-30表达系统构建pET-NspA表达重组子并获得了NspA融合蛋白，这些蛋白为研制对NspA相关疫苗以及脑膜炎奈瑟菌快速检测方法的建立奠定基础，现将结果报告如下。
参考文献
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