生物制药论文
利用转基因植物生产药用蛋白的研究进展
冯小雨
（陕西理工学院 生物学院 生物科学071班，陕西 汉中 723001）
指导教师：冯自立
[摘要]简要评述了利用转基因植物生产的药用蛋白种类和表达系统，利用转基因植物生产药用蛋白的研究现状、发展趋势,以及转基因植物生产药用蛋白的基本方法、应用研究等。尽管目前植物作为药用蛋白的生物反应器受到诸多因素限制,优点与问题并存,但利用转基因植物生产药用蛋白是植物基因工程研究领域的一个新的发展趋势。
[关键词]转基因植物;药用蛋白;生物反应器
引言
传统的生物医药基因工程常利用动物病毒、细菌、酵母等为生物反应器进行药用蛋白的生产,存在一些不足之处,如,细菌细胞不能进行许多病毒蛋白质的转录后的修饰作用,不利于蛋白质的正确折叠,导致其免疫性通常较弱;酵母菌对有些蛋白质的过分糖基化可能影响针对特定蛋白质的免疫反应,妨碍着酵母菌在一些疫苗生产中的应用;多数动物培养系统表达水平低,需要昂贵的生长培养基,且培养基需要特殊处理,因此疫苗成本很高,限制了其商品化应用。利用转基因植物作为生物反应器,把外源基因导入植物核基因组或叶绿体基因组中可以生产出在医学上有生物活性的药用蛋白,且可以克服其他反应系统的缺陷,成为药用蛋白生产的又一新途径。
1问题的提出
现代基因工程技术最初是建立在结构简单的微生物,尤其是大肠杆菌的基础之上的,最初都以大肠杆菌为受体表达外源蛋白,用转基因植物生产药用蛋白的思路出自偶然。八十年代末,比利时PGS公司的科学家将一个神经肽(enkephalin,脑啡肽)编码基因转入烟草中表达,用意在于让瘾君子们不用抽烟,只需拿烟叶闻一闻或放在口中嚼一嚼即可过烟瘾,以此减少尼古丁对人体的危害及减少空气污染。他们把这个小肽基因两端设计了两个蛋白酶的酶切位点,将改造后的基因串联导入烟草细胞并成功获得再生植株,结果小肽以多聚体的形式表达存在,用胰蛋白酶和羧肽酶作用后获得了神经肽,每粒种子在200nmol,然而,他们的目的最终没能达到,因为神经肽要经血液运输而起作用,在口腔及消化道内会被降解掉,但他们却意外地找到了一条转基植物生产神经肽的途径,引起人们对此领域的关注。运用相同的思路,美国Scripps研究所分别克隆了抗体的重链和轻链基因并转入烟草中,然后使两种转基因烟草杂交,在子代烟草叶片中产生了大量的抗体蛋白,表达水平占叶片总蛋白含量的1.3%,从而开创了用植物生产人、畜用疫苗的新时代,用此法生产抗 体可大大降低成本,生产规模大,可缓解目前疫苗紧缺的局面[1]。
2利用转基因植物生产的药用蛋白种类的研究进展
迄今为止,国内外利用转基因植物生物反应器研究和开发的药用蛋白、酶等已达100种以上,其中在植物中成功表达的药用蛋白质和多肽有:人的细胞因子、表皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体等。
2.1利用转基因植物生产的药用蛋白种类
2.1.1利用转基因植物生产动物口服疫苗
动物口服疫苗是将病原微生物的抗原编码基因进行克隆重组,导入植物受体细胞进行表达,其表达产物无需纯化,连同植物组织一起口服后可激发动物粘膜免疫,机体产生对该重组蛋白的保护性中和抗体。1992年Mason HS等首次报道了将乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)基因转入烟草中获得0.01%表达。1995年Mason HS又将HbsAg基因转入马铃薯中,并使其在块茎中专一性表达,用薯块饲喂小鼠,在小鼠体内检测到保护性抗体[2]。中国农业科学研究院生物技术研究所刘德虎等在马铃薯和番茄中成功地表达了乙肝表面抗原,将转基因马铃薯饲喂小鼠后,在小鼠血液中检测到乙肝病毒保护型抗体,滴度达10mV以上,该技术已经申请国家发明专利[3]。到目前为止,在转基因植物中表达成功的动物口服疫苗有:人的乙肝病毒疫苗、霍乱弧菌疫苗、肺结核疫苗、产肠毒素大肠杆菌疫苗、Norwalk病毒疫苗、狂犬病毒疫苗、涎腺病毒疫苗、轮状病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗和牙龋疫苗等。
2.1.2利用转基因植物生产动物保护性抗体
近几年,在植物中表达人和动物的抗体又成为植物基因工程研究领域的焦点,并出现了“植物抗体”这一新概念。它是指动物抗体基因或基因片段在植物中表达的免疫性产物。目前,已有几种转基因植物抗体具备潜在的商业价值:(1)在烟草中表达的抗链球菌表面抗原的分泌型IgG-IgA抗体(预防龋齿),临床实验证明该抗体预防链球菌腐蚀牙齿的效果与鼠淋巴瘤产生的单抗IgG类似。(2)在小麦和水稻中表达的抗癌胚抗原的抗体。癌胚抗原是细胞表面糖蛋白,也是肿瘤相关的特征抗原之一,该抗体在体内造像及肿瘤的免疫治疗方面有广泛的应用价值。(3)治疗单纯疱疹病毒的抗体,在大豆中表达的抗体Anti-HSV-2能有效的防止单纯疱疹病毒HSV-2在鼠阴道的存活,其活性与细胞培养得到的抗体相仿。(4)利用植物病毒载体表达的治疗淋巴瘤的抗体(ScFv),抗体基因来源于鼠B淋巴细胞瘤,利用该抗体免疫小鼠能使小鼠抵抗淋巴瘤的侵染。
2.1.3利用转基因植物生产药用蛋白和多肽
药用蛋白的市场需求量非常大,如纯化的血清白蛋白(HAS),全世界的年需求量为550t,传统的生产方法是从人的血液中分离提取,这样提取不仅价格较高而且还有病原微生物污染的危险。而今人们可以利用转基因植物进行生产。类似的植物性来源的药用蛋白质还有人的白介素、干扰素、脑啡肽、以及两种价格十分昂贵的药物:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和葡糖脑苷脂酶等。另外在近期的系列研究中,植物悬浮培养细胞也被用作药用蛋白的表达载体,如人白介素IF-2和IF-
4、核糖体抑活蛋白以及人抗胰蛋白酶等的表达生产。在上述研究中,烟草的悬浮细胞是人们的首选培养细胞,水稻细胞也曾被试验过。
3 转基因植物疫苗和药用蛋白的表达系统
3.1农杆菌介导的核转化系统
目前,研究成功的转基因植物药用蛋白中,有80%是由农杆菌介导形成的转基因植物表达系统生产。198
9、1990年Hi-att等巧妙地利用农杆菌介导方法获得分别表达重链和轻链蛋白的转基因植物,再通过杂交的方法解决了重链和轻链同时表达并组装成抗体。从杂交植物中产生的抗体占整个可溶性蛋白的1%。可以引起流行性急性肠胃炎的诺沃克病毒,抗原诺沃克病毒衣壳蛋白(NVCP)在转基因烟草叶片和马铃薯块茎中表达,其病毒抗原产率分别为总可溶性蛋白的0.23%和0.37%,饲喂小鼠均引起免疫反应[2]。
3.2植物病毒瞬时高效表达载体
常用的植物病毒载体有烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus,TMV)、番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TMV)、苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus,AIMV)和豇豆花叶病毒(Cowpeamosaic virus,CpMV)。1992年英国的Agricultural Genetics CorpanyAGC)报道他们将口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和艾滋病病毒(HIV-1)表面抗原基因导入豇豆花叶病毒(Cowpea mosaic virus,CpMV)基因组中,成功地在植物中获得动物疫苗。1998年,Modelska等将狂犬病病毒糖蛋白基因克隆到苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus,AIMV)外壳蛋白的开放阅读框中,分别在烟草和菠菜
中得到表达。
3.3植物叶绿体高效表达系统
近期大量研究结果表明外源基因可以在叶绿体中得到高效稳定表达。美国Stawb J等人利用烟草叶绿体成功地表达了有生物学活性的人生长激素,而且表达量占可溶性蛋白7.0%。中国农业科学研究院生物技术研究所叶绿体遗传工程室已分别将甲肝、乙肝抗原融合基因导入烟草和衣藻叶绿体中并达到表达。其中甲肝、丙肝抗原融合基因在衣藻中的
表达量占可溶性蛋白的5.1%[5]。
4 利用转基因植物生产医药蛋白的优点
利用转基因植物生产药物,具有常规的微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统所不可比拟的优越性。微生物系统缺乏真核生物的加工修饰系统,在发酵过程中常常产生一些不溶性聚合物,发酵常需要庞大的设备投资;动物细胞培养存在成本高、产量低以及对动物细胞生长干扰等缺点;以转基因动物作为生产系统较之利用植物将会成为更多公众或伦理关注的焦点,而且还有可能含有潜在的人类病原。而植物细胞培养、组织培养、植株再生较容易,且植物基因工程疫苗不需严格的纯化程序。利用转基因植物大规模生产治疗和诊断用的医用抗体,生产成本比任何来源的抗体都要低;转基因植物能对真核蛋白质疫苗进行准确的翻译后加工修饰,保持了自然状态的免疫原性;植物生产基因工程疫苗使用方便,植物抗体易保藏,不需提取便可直接用于预防和治疗某些疾病且可直接口服免疫,易于生产、运输、推广和普及。利用植物表达系统已成功地表达了多种药用蛋白,在动物实验和人体实验方面也已取得了重要进展。 [6]
5利用转基因植物生产医药蛋白的缺点及改进措施
虽然利用转基因植物生产药用蛋白的研究已取得了丰硕的成果，但是要发展成为一个廉价、高效、大规模的成熟的生物反应系统，还需解决一系列问题，同时植物生物反应器引起的生物安全性问题也需要认真对待。
5.1蛋白表达量低
蛋白表达量低,一方面无法达到商业化生产剂量。这可以考虑使用强启动子、前导序列和增强子,优化选择密码子,mRNA去稳定序列的去除,整合性表达,通过协同表达二硫键异构酶或伴侣蛋白促进蛋白质的正确折叠,特别是近几年发展起来的叶绿体遗传转化技术,使外源基因在叶绿体中实现稳定高效表达,将外源蛋白定位于植物某一特定的器官、组织或细胞内来提高表达水平,这也可简化蛋白质的分离纯化过程;蛋白表达量低,另一方面转基因植物疫苗的有效成份含量转低,口服这种疫苗不但会诱发机体的保护性免疫反应,相反会引起免疫耐受性,这也是应该引起注意的反面效果。
5.2选择合适的目标植物
目前烟草被广泛用于转基因疫苗的研制,主要是因为烟草的遗传背景研究得较清楚,而且易于操作,但烟草含有尼古丁等生物碱或毒素,需纯化后才能食用。对于某些必须加工方可食用的植物,烹调过程会使疫苗蛋白变性,降低或消除诱导免疫能力。目前正在通过研制转基因香蕉和番茄等可直接生食的植物来克服这一困难。研究发现采用口感较好的香蕉和西红柿来表达任一口服疫苗、用苜蓿、大豆和谷类植物来表达动物用口服疫苗效果较好。另外,玉米作为体中主要的饲料来源,在其中表达抗原基因以后,成本低,使用方便.
5.3安全性问题
转基因植物引起的生物安全性问题主要包括转基因后引发植物致病的可能性，基因漂流至相关物种的可能性，演变成杂草的可能性以及对非靶生物和生态环境的影响。另外，转基因植物中外源基因编码蛋白是否含有过敏源，是否会发生转移，非目的基因如启动子，载体骨架序列和基因标记等方面引起的安全性也引起了人们的广泛重视[8]。
5.4用植物系统生产疫苗及功能蛋白， [7]
从生产上来说可划分为三个阶段:(1)转基因植物“种子库”的建立(种子繁殖或种苗无性繁殖)或重组病毒“种库”的建立;(2)转基因植物或重组病毒的大规模生产;(3)功能蛋白的分离、提取、鉴定及制成人用制品。究竟是由一家单位包揽所有的生产阶段，还是由几家单位协作，共同完成其全过程，又将面临管理上的问。
5.5其他方面
从植物细胞中提纯特定大蛋白质比较困难,可能混杂的植物碱和植物毒素难以清除,相应的纯化工艺有待进一步完善。
口服的转基因植物疫苗必须有酶的耐受性,足以通过粘膜进入内脏而不被酶消化,并能在那里激发免疫反应。这可采取在抗原基因附近加上一些修饰或吸附基因序列,保护口服疫苗不易被迅速消化,促进其进入机体内。尽管目前在植物医药蛋白的研制和开发过程中还有许多问题需要进一步研究和探讨,但利用转基因植物开发新型医药蛋白必将成为一种经济有效的新途径,它将控制甚至彻底根除人类和动物某些疾病,造福人类。 [9]
6 国内外该领域生物技术的发展趋势和方向
植物作为生产药用蛋白的生物反应器,为人类提供了一个更加安全和廉价的生产体系。与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比,它具有许多潜在的优势。如微生物系统不能对真核生物蛋白进行准确的翻译后加工和蛋白糖基化;细菌在发酵过程中常常产生一些不溶性聚合物,而将这些聚合物重新溶解并折叠成天然蛋白质,则需要很高的成本,此外,发酵常需要庞大的设备投资;而动物细胞培养所需生长培养基相当昂贵;以转基因动物作为生产系统较之利用植物将会成为更多公众或伦理关注的焦点,况且更重要的是,植物中绝对不会含有潜在的人类病原。
尽管植物生产体系具有许多优点,植物上游生产成本也比其它系统都低,但勿用置疑,植物生物产品的下游加工通常被认为是极其困难而又非常昂贵的,原因就在于重组蛋白质占植物总生物量的比值很低。鉴于上述情况,该领域生物技术今后的发展方向主要侧重于以下3个方面:1.提高植物中外源蛋白表达量;2.改变表达策略,降低下游生产成本;3.减少或避免纯化过程。
虽然外源蛋白质在植物中的表达水平现在还比较低,但却存在很多改进的可能性。为了在植物中获得蛋白质的高水平表达,一般应考虑以下几点:1.适当的启动子、增强子和前导序列的选择;2.密码子的优化;3.mRNA不稳定序列的去除;4.选用其它植物种(大多数工作都在烟草中进行);5.整合非依赖性表达;6.通过修饰外源蛋白基因将其定靶于细胞的不同空间(如叶绿体、液胞或内质网);7.以及通过协同表达二硫键异构酶或伴侣蛋白促进蛋白质的正确折叠。然而,一些单一的方法虽然已有介绍,但旨在提高具有商业价值的蛋白质在整个生物量中表达水平的综合方法尚未见报道,而这些是为降低下游加工成本时必须考虑的重要因素。
利用转基因植物生产口服疫苗可避免或至少减免部分纯化过程,这样就大大降低了生产成本。对负担不起目前流行疫苗的发展中国家的贫穷人口来说,植物口服疫苗便宜的就象“食品添加剂”。而且,口服疫苗又是极其安全的。从长远的观点出发,植物将在未来的疫苗市场具有一席之地[10]。 7 利用植物生产药用蛋白前景展望
用转基因植物生物反应器生产有医疗价值的抗体、疫苗及一些重要药用蛋白,具有一定的优势和良好的前景。随着人类基因组计划的逐渐深入,人们将会发现更多的有医疗作用的蛋白质,进而需要生产和使用这些重要的重组产物。转基因植物将会成为主要的生产系统之一,不断为人类健康提供充足的药物来源,大片的“分子药田”将会成为现实.
参考文献
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[11]陈玉辉,赵凌侠,崔丽洁,唐克轩.转基因植物生产药用蛋白研究进展[A].中国农业科技导报, 2007, 9(5): 36-44.
The development in studying the transgenic plants
producing medical protein
Feng Xiaoyu
（Grade4,Cla1, Major biological science, School of Biological Science & Engineering, Shaanxi
University of Technology, Hanzhong 723000, Shaanxi）”
Tutor: Feng Zili
Abstract：It summarizes the present study situation,development tendency with the transgenic plants pro-ducing medical protein and the basic method and application research home and abroad.Although there area lot of facts that limited the plants acting as bioreactor of the medical protein,the advantages and disad-vantages coexist at present,it is a new development tendency in using transgenic plants to produce medicalprotein in plant gene engineering study.
Key words：transgenic plants;medical protein;bioreactor
