武汉工业学院
研究生课程论文
课程名称
食品生物技术
任课教师
陈 季 旺
考生姓名
李亚楠
考生学号
3201101010
考生专业
食品工程专业
所在院系
食品科学与工程学院
提交日期
2012 年 2 月 26 日
课程论文成绩：
，占
％；平时成绩：
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％；总评成绩：
。
课程论文评语：
任课教师签名： 年
月
日
基因工程与荔枝保鲜
摘 要：近30年来,植物基因工程的研究进展较快,在植物抗病、抗虫、抗除草剂和改良植物的某些成分方面都已得到了不少转基因植株;为提高植物的产量、抗逆性、改善其品质的良种选育提供了一条新途径。 基因工程在动植物育种生物多样性以及医学等方面已经表现出了明显的优势，基因工程在果蔬保鲜方面也已崭露头角。抗坏血酸过氧化物酶（APX）是一种重要的末端氧化酶， 能够清除机体内的活性氧，保护延缓机体的衰老。采用基因工程调控APX基因在荔枝中的表达,可达到延长荔枝的贮藏保鲜时间的目的。 关键词：基因工程；荔枝；保鲜；抗坏血酸过氧化物酶（APX）
Abstract: For nearly 30 years, the research of plant gene engineering progre become fast, in plant disease resistance, insects resistance, herbicide resistance and improvement of the plant in certain part has been got a lot of transgenic plants; provides a new way for improve the plant production, resistant, improve their quality breeding.Genetic engineering have show great advantages in animal and plant breeding biodiversity and medicine, etc, Genetic engineering has also covered in fresh-keeping aspects.Ascorbic acid peroxidase (APX) is a kind of important end oxidase, can remove the reactive oxygen species in plant, delay aging of the plant.Using genetic engineering control the APX gene expreion in litchi,To achieve the purpose of Extend the litchi storage time.Key words: genetic engineering; litchi; fresh-keeping; Ascorbic acid peroxidase(APX)
前
言
以DNA重组为核心内容的基因工程技术是一种新兴的现代生物技术。利用基因工程技术不但可以提高食品的营养价值，去除食物原料中的有害成分，同时还可以通过对农作物品种改良，减少种植过程中农药、化肥等化学品的使用量。目前，经基因工程改造的产品已在农业、医药、环保等领域占据了重要的地位，特别是在食品工业中越来越显示了它的优越性和发展前景。基因工程技术在食品领域中的作用目前涉及到对食品资源的改造、对食品品质的改造、新产品的开发、食品添加剂的生产以及食品卫生检测等方面。基因工程问世30多年来，无论是基础理论研究领域，还是在生产实际应用方面，都取得了惊人的成绩，给国民经济的发展和人类社会的进步带来了深刻而广泛的影响，同时为食品工业开拓了广阔的发展空间[1]。
1 基因工程技术 1.1 基因工程定义
基因工程( genetic engineering)技术是指按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质 DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物 （供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
基因工程的基本程序：（1）从某些生物细胞中获取所需的目的基因，或在人工控制下合成目的基因；（2）把目的基因与选好的载体通过体外重组的方式连接在一起；（3）把重组载体转入宿主细胞；（4）对重组分子进行选择；（5）表达成蛋白，采用合适条件，获得高表达的产品。 1.2 基因工程的发展
1857年至1864年，孟德尔通过豌豆杂交试验，提出生物体的性状是由遗传因子控制的。1909年，丹麦生物学家约翰生首先提出用基因一词代替孟德尔的遗传因子。1910年至 1915年，美国遗传学家摩尔根通过果蝇试验，首次将代表某一性状的基因同特定的染色体联系起来，创立了基因学说[2]。
20世纪 50年代初开始，由于分子生物学和生物化学的发展，对生物细胞核中存在的脱氧核糖核酸( DNA )结构和功能有了比较清晰的阐述。70年代初实现了 DNA重组技术或称为克隆技术，逐步形成了以基因工程为核心内容，包括细胞工程、酶工程、发酵工程的生物技术。这一技术发展到今天，正在形成产业化并成为世界领先专业技术领域之一，广泛应用于食品、医药、化工、农业、环保、能源和国防等许多部门，并日益显示出其巨大的潜力，将为全球面临的蛋白质缺乏、能源、环保和癌症治疗等问题的解决提供广阔的应用前景。
1973年美国斯坦福大学和旧金山大学 Coken和 Boyer两位科学家成功地进行了 DNA 分子重组试验，揭开了基因工程发展的序幕。1984年，Bevan报告了从粪链球菌中提取的基因植入烟草(Nicotina plum bag in ifolia )的基因组，开创了转基因生物时代。1994年，美国农业部 ( USDA )和美国食品与药品管理局 ( FDA )批准第一个转基因作物产品——延熟保鲜转基因番茄进入市场之后，大量的转基因生物作为食品进入人们的生活[1]。
2 基因工程在食品工业中的应用 2.1 改善食品原料品质
基因工程应用于植物食品原料的生产上，可进行品种改良，新品种开发与原料增产，如选育抗病 植物、耐除草剂植物、抗昆虫或抗病毒植物、耐盐或耐旱植物。除增加产量外，还应用于改良农作物品种特性方面[3]。 2.2 改良食品工业用菌种
最早成功应用的基因工程菌是面包酵母菌。人们把编码麦芽糖透性酶及麦芽糖酶的基因转移至该食品微生物中，通过表达使该酵母含有的麦芽糖透性酶及麦芽糖酶的含量大大提高，从而在面包发酵过程中产生较多的 CO2气体,使面包膨发性能良好、松软可口。另据 Meyer报道，由于丝状真菌具有独特的高容量表达和分泌蛋白的能力，可利用其生产真菌或非真菌来源的酶类，通过基因工程技术可以有效地提高产率及减少非需要的副产物的形成。 2.3 酶制剂方面的应用
酶的传统来源是动物脏器和植物种子，随着发酵工程的发展,逐渐出现了以微生物为主要酶源的格局。近年来,基因工程技术的发展，使人们可以按照需要来定向改造酶, 甚至创造出自然界从未发现的新酶种。目前，蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、糖化酶和植物酶等均可利用基因工程技术进行生产[2]。 2.4 改良食品加工性能
采用基因工程技术，使大麦中醇溶蛋白含量降低，以适应生产的要求。增加牛乳中增加k—酪蛋白编码基因的拷贝数和置换，使k—酪蛋白分子间斥力增加，以提高牛粗的稳定性，这对防止消毒奶沉淀和炼乳凝结起重要作用。在烘烤工业中，将含有地丝菌属 LIPZ基因的质粒转化到面包酵母中，可以使面包蓬松，内部结构较均匀，优化了加工工艺。 2.5 生产保健食品
目前，保健食品的开发可采用转基因手段，在动、植物细胞中得到基因表达而制造有益于人类健康的保健成分或保健因子。此外，基因工程技术还可以用于提高食品中矿物质和天然存在的抗氧化维生素 ( VA、VC、VE )等保健因子水平，这些物质可以减慢和阻止氧化作用，如在番茄和甜椒中大量存在的番茄红素已经用转基因技术得到生产。 2.6 食品检测
近年来 DNA探针杂交技术在食品微生物检测中的应用研究十分活跃，DNA探针杂交技术具有特异性强、灵敏度高及操作简便快速等特点，将是今后食品微生物检测技术的一个重要发展方向。目前该技术已用于多种食品中致病菌的检测。
3 基因工程与果蔬保鲜
如何使果蔬延缓衰老，延长保鲜期一直是人们所研究的重要问题，每天数以万计的水果和蔬菜在贮藏和运输中损耗。近代对果实和蔬菜的保鲜问题，一般以控制采后温度、贮藏环境的气体成分，保鲜剂和抗衰老剂的使用，从而抑制器官的呼吸和乙烯释放来解决，但成本较高，需要如冷库等设备和较高技术。另一方面，为了便于贮运，必须提早采收，从而影响品质和质量，降低商品价值。这些方法都存在自身弱点，保鲜效果不很理想，不能完全从根本上解决问题。
近十年来，植物分子生物学的迅速发展，可运用基因工程技术获得转基因植物，不仅对于研究植物成熟和衰老机理具有重要意义，也为应用基因工程技术为植物延缓成熟和衰老，延长保鲜期和贮藏期具有重要实际意义[4]。
4 荔枝保鲜的意义
荔枝是深受人们喜爱的亚热带水果，营养丰富，色泽艳美是驰名中外的名贵水果,也是最不耐贮藏的果品之一，由于荔枝果实的结构特殊、代谢旺盛，又因采摘季节极短暂且集中在炎热的夏天，水分蒸发干耗率高，故变质极快，造成荔枝商品性快速降低。烂荔枝素有：“一日而色变，二日而香变，三日而味变，四五日外，色香味尽去矣”的特点。
荔枝历来素有“中华之珍果”的美称，是我国在国际市场上最具有竞争力的水果之一。荔枝有较好的经济效益，刺激了荔枝的发展，全国荔枝栽培面积和产量由1988年的15.66万公顷，12万吨，猛增到2004年的599921.88万公顷，629.32万吨。16年内面积增加了38309倍，产量增加了52倍。据统计，荔枝每年因腐烂变质而造成的损失约占总产量的20%以上。同时，鲜荔枝的贮运保鲜困难，也限制了其长途运输和销售，制约了地域市场的开拓。同时果实销售问题不解决，必将影响到果农的经济收入，挫伤果农的积极性。因此，开展荔枝保鲜技术的研究，对于扩大我国的荔枝外销、扩大出口，丰富广大人民的物质生活，促进果农增入，具有十分重大的现实意义[5]。
5 荔枝果实的主要生理生化及保鲜特性
荔枝果实属非呼吸跃变型水果。含糖量高(可溶性固形物大多在18%以上，有的可达21-22%)，含酸罩低(约0.1%)的水果。从荔枝采后生理特性(呼吸特性，乙烯释放量及营养成分变化)来看，在常温(25℃)条件下，荔枝鲜果呼吸强度接近直线上升，没有出现明显的呼吸高，贮藏5天就开始腐烂。而在4℃~6℃条件下，呼吸强度大大降低，而且有随着贮藏时间的延长呈逐步下降的趋势。说明低温明显地抑制了呼吸强度，有效地减缓了衰老。可见，低温贮藏保鲜是延长保鲜期的主要手段之一。乙烯一直被人们认为是水果采后的“衰老激素”，但从实验测定数据看，荔枝鲜果乙烯释放量在308毫微升/克·小时以下，比起香蕉等其他水果低得多。
从营养成分来看，荔枝果汁含酸量比柑桔低得多，属低酸高糖水果，因此，维生素在缺乏酸的保护下易被破坏。经贮藏保鲜的荔枝果实，其维生素C含量明显下降。由此可见，荔枝不宜长期贮藏。
荔枝的腐败变质多从果实内部开始，即由荔枝本身酶的作用产生自溶现象，破坏了果肉表面保护膜，果汁外溢，引起各种微生物滋生，从而加速整个果肉腐败，其腐烂进程是：果肉流汁→蒂周腐烂→果肉全部腐烂→整果腐烂长霉。
6 荔枝保鲜新方法探究
荔枝果实采后快速衰老产生大量的活性氧，细胞内的活性氧如不及时清除，就会导致氧化胁迫。植物体内主要通过抗氧化酶和抗氧化物质来清除活性氧。抗氧化物质主要包括抗坏血酸(ascorbate，AsA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)。AsA可以直接与单线态氧、超氧自由基、过氧化氢和羟自由基等活性氧作用而减轻氧化伤害；也可以通过抗坏血酸-谷胱甘肽(ascorbate-glutathione cycle， AsA-GSH)循环分解 H2O2，降低 H2O2对细胞的伤害[6]。 6.1 抗坏血酸过氧化物酶( APX) 过氧化氢(H2O2)会通过金属催化的 Haber- Wei 反应生成高度活泼的羟基自由基(·OH)·OH 能氧化几乎所有的细胞组分，并引起细胞的破坏。因此，对于所有的好氧生化过程来说，及时清除H2O2对于维持植物正常的生理功能很重要。 植物抗坏血酸过氧化物酶( APX)是植物细胞叶绿体和细胞质 中清除 H2O2的主要酶类，对于延缓机体的衰老起到重要作用。
APX转基因的正义表达，可以提高转基因植物的抗逆性。近年来，其重要的生理生化功能已得到广泛关注。 例如转基因烟草过量表达的 tAPX活性比野生型的提高了 37倍，能有效地抗氧化胁迫。拟南芥中 tAPX的过量表达增强了对除草剂 Paraquat ( 1，1 二甲基 4，4 联吡啶二氯化物) 诱导的光合氧化胁迫和氧化氮诱导的细胞死亡的抗性。除植物因遇逆境而产生的过量活性氧，外源 APX基因的表达还可能会激发内源 SOD 基因的超量表达，因而转APX基因品系的SOD活性得以提高。提高植物体内抗氧化酶活性和增强抗氧化代谢的水平是提高植物抗逆性的有效途径之一。APX能提高氧化耐受性的作用已有报道。 6.2 APX基因的克隆
人们已从棉花、拟南芥等植物中克隆了APX基因，并进行了部分转基因植物的研究。 Kornyeyev等获得了转叶绿体APX基因的棉花植株， APX在植物体内过量表达，其叶片中 APX活性比野生型的提高了5倍。王庆斌等获得了转APX基因的水稻植株并研究了其功能，发现 APX基因植株中可能表达 APX的相关蛋白，可以抵抗甲基紫精的氧化胁迫，有效保护膜系统。Kornyeyev 等将SOD、tAPX、谷胱甘肽还原酶 ( glutathione reductase，GR) 基因分别导入棉花中，得到过量表达，所有转基因棉花具有较高的PSⅡ光化学活性和抗氧化能力。Wang 等获得的转 tAPX 烟草植株，其APX活性明显提高，抗低温的能力也增强。 Charles 等在研究大豆 cAPXs 中观察到，APX 的转录、翻译和翻译后调控可能增强农作物抵抗环境胁迫的能力。从荔枝果皮中克隆 APX基因 cDNA序列的结果也已见报道[7]。
6.3 荔枝中APX基因的表达
对荔枝抗坏血酸过氧化物酶基因进行初步的表达分析，得到的结果显示，在采后 24~48h基因表达量迅速升高，可能是这时活性氧积累到达一定的程度，诱导抗坏血酸过氧化物酶高表达。在48h后升高幅度减缓，说明在前期24~48h酶基因的表达产生大量的酶蛋白，清除活性氧。对此认为抗坏血酸过氧化物酶基因的变化在对荔枝果皮抗衰老过程中较敏感。在以后的研究中，可考虑将APX基因转入中间载体后，进行转基因植物的研究，探讨外源或内源APX基因对植物采后衰老和荔枝果皮褐变的影响[8]。
展
望
植物果实的衰老是由多种基因控制和调节的，要想有效的提高植物的这些性状，对于植物感受和传单信息的机制，以及调控植物衰老确切的复杂分子机理尚需深入研究，转录因子怎样调控各种抗性基因的表达，这些基因如何发挥活性。只有弄清这些分子机理，进一步利用现有的生物化学及分子生物手段分离，鉴定基因所有成员，才能更有效的应用到植物保鲜中。
与果实成熟的相关基因已陆续被研究，转基因技术和反义RNA技术在延长果实保鲜期方面的应用已逐渐成熟。采用基因工程技术能从根本上延长果实货架期，防止果实腐烂，提高经济效益，在将来必将有非常好的应用前景。
参考文献：
[1] 张占军, 王富花.基因工程技术在食品工业中的研究进展[J].生物技术通报, 2011 (2) 75-79 [2] 邵学良, 刘志伟.基因工程在食品工业中的应用[J].生物技术通报, 2009 (7) 1-4 [3] 李志军, 薛长湖, 李八方, 等.基因工程技术在食品工业中的应用[J].食品科技, 2002 ( 6) : 12 [4] 金勇丰, 张上隆, 张耀洲.基因工程在园艺作物采后保鲜中的应用[J].生命科学, 1996 8(4): 46-48 [5] 樊刚伦.荔枝保鲜技术的现状及其发展方向[J].科技资讯, 2006 (28) : 254-255 [6] Foyer C H，Halliwell B．Presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts：A proposed role in ascorbic acid metabolism[J]．Planta，1976，(167) ：521-526．
[7] 赖建勋, 金志强, 王家保.荔枝抗坏血酸过氧化物酶cDNA的克隆和分析[J].安徽农业科学，2007 35(26) : 8164-8167 [8] 赖建勋, 金志强, 王家保.采后荔枝果皮抗坏血酸过氧化物酶基因的差异表达试验初报[J].现代农业科技, 2007 (14) : 7-9
