路边食品微生物的含量检测
摘要 随着我们生活水平的日益提高，食品在满足我们大众需要的同时慢慢走进我们的生活，路边摊食品成为一道独特的风景线，路边摊食品在满足我们的同时，也衍生出来许多问题，而且长久以来都被我们忽视。 路边摊地处室外，灰尘多、病菌多、污染重。因其流动性大，食品的质量、安全均无法保证，容易引发食物中毒和食源性疾病；加热食物直接装在白色塑料袋或塑料碗里，塑料制品释放出来的有毒物质致使食用过程中存在很大安全隐患；路边摊油炸食品用油来源不确定性大，炸出来的食品中含有大量的致癌物质；路边刨冰、奶茶等食品非法添加色素、防腐剂和香料，长期食用会对青少年的身体造成伤害。前一段时间路边毛蛋含有大量病菌造成食物中毒现象，引发了社会的广泛关注。
关键词：路边食物微生物含量检测
一、食物中常见微生物及其危害
根据食品微生物学而知，食品中常见病原微生物有：黄曲霉菌，会产生黄曲霉毒素，常见于花生等农作物种子中；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；疯牛病病毒；禽流感病毒；布鲁氏杆菌，炭疽杆菌等。
1、黄曲霉毒素
它是一种剧毒物质，毒性比KCN大10倍，比砒霜大68倍，仅次肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。它的毒害作用，无论对任何动物，主要变化是肝脏，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。长期摄入小剂量的黄曲霉毒素则造成慢性中毒。其主要变化特征为肝脏出现慢性损伤，如肝实质细胞变性、肝硬化等。出现动物生长发育迟缓，体重减轻，母畜不孕或产仔少等系列症状。黄曲霉毒素目前所知致癌性最强的化学物质，主要诱发肝癌，还可诱发胃癌、肾癌、泪腺癌、直肠癌、乳腺癌，卵巢及小肠等部位的肿瘤，还可出现畸胎。
2、金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌肠炎是金黄色葡萄球菌引起的，多因原发疾病长期用抗生素引起肠道菌群失调所致，抗生素敏感菌株受到抑制，耐药的金黄色葡萄球菌株趁机繁殖。金黄色葡萄球菌为侵袭性细菌，能产生毒素，对肠道破坏性大，所以金黄色葡萄球菌肠炎起病急，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻。呕吐常在发热前出现，发热很高。轻症大便次数稍多，为黄绿色糊状便；重症大便次数频繁，每日可达数十次，大便呈暗绿色水样便，外观像海水，所以叫海水样便。粘液多，有腥臭味，有时可排出片状伪膜，将伪膜放入生理水，脱落的肠粘膜即漂在水面上，对诊断帮助很大。体液损失多，患儿脱水、电解质紊乱和酸中毒严重，可发生休克。
3、大肠杆菌
正常情况下，大多数大肠杆菌是非常安分守己的，他们不但不会给我们的身体健康带来任何危害，反而还能竞争性抵御致病菌的进攻，同时还能帮助合成维生素K2，与人体是互利共生的关系。只有在机体免疫力降低、肠道长期缺乏刺激等特殊情况下，这些平日里的良民才会兴风作浪，移居到肠道以外的地方，例如胆囊、
尿道、膀胱、阑尾等地，造成相应部位的感染或全身播散性感染。因此，大部分大肠杆菌通常被看作机会致病菌。
4、禽流感病毒
一般来说，禽流感病毒与人流感病毒存在受体特异性差异，禽流感病毒是不容易感染给人类。 感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N
1、H9N
2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株（H5N
1、H7N
7、H9N2），可经6～9个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株（H5N1）。
5、炭疽杆菌
炭疽杆菌从损伤的皮肤、胃肠粘膜及呼吸道进入人体后，首先在局部繁殖，产生毒素而致组织及脏器发生出血性浸润、坏死和高度水肿，形成原发性皮肤炭疽、肠炭疽的肺炭疽等。当机体抵抗力降低时，致病菌即迅速沿淋巴管及血管向全身扩散，形成败血症和继发性脑膜炎。皮肤炭疽因缺血及毒素的作用，真皮的神经纤维发生变化，故病灶处常无明显的疼痛感。炭疽杆菌的毒素可直接损伤血管的内皮细胞，使血管壁的通透性增加，导致有效血容量减少，微循环灌注量下降，血液呈高凝状态，出现DIC和感染性休克。
二、微生物快速检测方法：
1、电化学法
电化学阻抗技术是指细菌在培养基内生长繁殖的过程中，会使培养基中的大分子电化学惰性物质（如碳水化合物）可以代谢为具有电活性的小分子物质（如乳酸盐），这些离子态物质能增加培养基的导电性和氧化还原性，使培养基的电化学性质发生变化。通过检测培养基的在电极表面体现的电压、电流、电阻抗等变化情况，即可判定细菌在培养基中的生长、繁殖特性。该法已用于食品中细菌总数、大肠杆菌、沙门氏菌、酵母菌、霉菌和支原体的检测，具有高敏感性、特异性、快速反应性和高度重复性等优点。
2、载体法
载体法包括快速测试片法、螺旋板系统法和滤膜法。载体法将稀释、培养和显色融为一体,大大简化了分析步骤,节约分析时间,并且可以在取样的同时接种,结果更能反映当时样本中真实的细菌数,更准确。
2.1、微生物测试片
可检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数。目前国际先进的产品除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门菌、葡萄球菌的功能。这种微生物测试片方法与传统检测方法之间的相关性非常好。使用时只要正确掌握操作技术和判断标准，就可以达到理想的检测效果，例如，霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中霉菌的检测，操作起来非常简便。操作起来非常简便，仅需36℃培养，不需要低温设备，大大节约了检测时间，一般仅需2d就可观察到结果，从而大大提高了工作效率。实际效果上，纸片法与国标法在霉菌检出率上 差异无显著性，且菌落典型，易判定。
2.2、滤膜法
将滤膜放入滤器过滤样品，滤膜保留微生物，样品中生长抑制剂可用无菌水冲洗滤器除去，然后将滤膜放在培养基上培养，在滤膜表面上培养出的菌落可计数。
2.3、旋转平板和激光菌落扫描法
在琼脂培养基表面倒一薄层样品，在平板旋转作用下液体从中心向边缘流动，分布均匀。采用激光菌落计数器计算菌落的数量，利用仪器底部的光检测仪扫描平
板，激光束通过菌落时可降低光强度，从而检测菌落的存在。
3、免疫学技术
免疫学技术是以抗原与抗体的特异性结合作为基础，再配合免疫放大技术，从而检测微生物的方法。使用这种方法，样品在进行增菌以后，不需要再分离，就可以对其进行筛选，并且灵敏度高，样品在经过增菌以后可以在非常短的时间 内就达到检出度，并且抗原和抗体结合的反应也可在很短时间便完成，目前在基层单位这种快速检测技术最为广泛的。免疫学技术包括免疫荧光技术（IFT）、酶免疫技术、免疫印迹技术、免疫层析技术、免疫磁珠分离技术、酶联荧光免疫 分析技术等。
4、PCR法
聚合酶链式反应PCR，可以在试管中建立反应，数小时后能将极微量的目的 基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。微生物快速检测中，可以 利用PCR技术将特异性DNA片段进行扩增识别目标细菌。 由于PCR灵敏度高，理 论上可以检出一个细菌的拷贝基因， 因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不 增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间。
5、大肠杆菌快速检测
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被广泛应用于食品卫生工作中。快速检测与国标法相对应，由原来几步的试验简化为一步，时间由一个星期左右缩短为十几个小时，而且省去了制备培养基和清洗器皿的麻烦。具体方法将不同量的水样接种到含有乳糖、显色剂和选择性培养基的快速检验纸片上，经培养后能够在纸片上生长并发酵乳糖产酸的即为大肠菌群阳性， 根据阳性反应结果可测出原水样中大肠菌群的MPN（最可能数）值。
三、食物中微生物含量的检测
由于路边食物中含有多种微生物，而且每种微生物含量的检测方法存在相似性，本文主要以大肠杆菌含量的检测为例，其他种类微生物含量可参照《国家微生物检测标准》进行检测。
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断路边食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料
1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃。
1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂
2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3 操作步骤
3.1 检样稀释
3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
3.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
3.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
3.4 证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
3.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
4 粪大肠菌群(faecal coliform)
4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
4.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。
四、如何防止微生物对食品的危害
造成食物变质的因素可归纳为物理、化学、酶及微生物等4个方面，其中微生物对食物品质的影响最为严重。引起食物中毒的微生物这类微生物并不是很多，它们包括可感染的细菌，如沙门氏菌属和弯曲菌属以及可产毒的细菌，如金黄色葡萄球菌的肉梭状芽孢杆菌等。 可引起食物腐败的微生物引起食物腐败的微生物种类较多，除众多革兰氏阴性或阳性、产生或不产生过氧化氢酶、可形成芽孢或不形成芽孢的杆菌及球菌外，还有酵母与霉菌等。 防止微生物的危害，主要以使微生物丧失活性或者延缓、阻止它们的生长为出发点；要考虑到与之相关的物理、化学和微生物等等诸多因素。
低温12℃左右和3．5℃左右是两个比较重要的温度。12℃是产气荚膜芽孢杆菌和可分解蛋白质的肉梭状芽孢杆菌的生长低限；而3．5℃是不能分解蛋白质的肉梭状芽孢杆菌的生长低限。当温度在0℃以下时，多种微生物仍可繁殖；即使温度达到－10℃，有些菌仍可非常缓慢地繁殖。到目前为止，都是以低于不能使肉毒杆菌繁殖的温度作为冷冻贮存的温度。因此，在许多国家中，冷冻贮存的温度通常为－18℃或更低。
降低水分活性能引起食物中毒及食物腐败的最低AW值在0．86～0．95之间不等。当AW值接近此数值时，微生物的繁殖能力很低；当温度和较低的AW值联合作用时，会有很明显的作用效果。因此，用降低AW值的方法保藏食物时，同时采用冷冻贮存，其效果显著提高。
真空与气调包装目前，真空包装与气调包装得到了广泛应用。采用真空充氮或二氧化碳的包装方法，可阻止或大大减缓微生物的繁殖。
酸化pH值为4．5时是一个临界点。当其值低于4．5时，一般认为产气荚膜芽孢杆菌不能够在食品中生长。在pH值低于4．2时，多数能引起食物腐败的微生物会被有效地抑制。但一些耐酸细菌，如乳酸菌、酵母菌和霉菌在pH值低于3的条件下仍可生长。
乳化奶油、人造奶油和含脂肪食品，它们是脂肪与水的乳液，这种乳液结构使它们具有一定的防腐性能。如果加工乳液时能保持清洁的环境，那么乳液中所含有的微细小滴便不会被微生物污染，而且在乳液中，微生物进入微细小滴的途径又被周围的脂膜液体所阻挡。因此，这种食品的防腐性能主要取决于加工过程的卫生条件和乳液的稳定性。
加热加热可使微生物失活，而不像其他方法那样只是抑制微生物的生长。需要特别指出的是，加热与防腐剂之间有协同作用，即在低于微生物失活的加热温度下，可大大增加微生物对于一些防腐剂或其他因素的敏感性。
防腐剂的作用大多数有效且广泛应用的防腐剂都是各种有机酸或它们的酸盐、酸酯等。而且这些防腐剂在低pH值下较之在高pH值条件下更为有效。其中，只有尼泊金酯在pH值接近中性仍具有有效的抗菌作用。
[参考文献]
自己编
