成
绩：
教师签名：
生物化学实验设计
姓 名 学 号 专业班级 任课教师
实验题目：血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳
一、实验目的：
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术，了解电泳技术的基本原理，测定人血清中各种蛋白质的相对含量。
二、实验原理
醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作支持物的一种区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：①电泳后区带界限清晰；②通电时间较短（二十分钟至一小时）；③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。
本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同，在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性PH 缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。
醋酸纤维薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类，pH 和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响，若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸 盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多物质必须经染色剂显色。
醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后，CAM 经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、α
1、α
2、β、γ—球蛋白5条区带，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。
三、实验仪器与设备
醋酸纤维薄膜(8X2mm)；点样器；染色皿，漂洗器，镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳槽；粗滤纸；直尺和铅笔
三、实验材料
四、
（一）、材料：人血清
（二）、药品
巴比妥缓冲液(pH8.6 I=0.06)；氨基黑10B 染色液；漂洗液；95％乙醇45ml、冰醋酸5ml ；蒸馏水50ml ；洗脱液 0.4mol ／NaOH ；透明液；无水乙醇：冰醋酸＝7：3
五、实验步骤：
1、仪器与薄膜的准备
（1）醋酸纤维薄膜的选择与润湿
用镊子取一片薄膜，在距醋纤膜一端1.5cm 用铅笔作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，小心放在盛有缓冲液的培养皿中。若漂浮在液面的薄膜在15～30秒内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此薄膜均匀可以用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹或斑点，则表示薄膜不均匀应弃去，以免影响电泳结果。浸泡于缓冲液中约30分钟，当完全浸透后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸干，方可用于电泳。 （2）电泳槽的准备
将电泳槽置于水平平台上，将缓冲液注入电泳槽中，两边的电极槽缓冲液的高度要在同一平面。根据电泳槽支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在电泳槽的两个膜支架上, 各放2～４层滤纸条, 使滤纸一端的长边与支架前沿对齐, 另一端浸入电极缓冲液中。当滤纸条全部润湿后, 用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气泡, 使滤纸的一端紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。
2、点样
将点样器先在白瓷反应砖上的血清中沾一下，点样前应在滤纸上反复练习，此步是实验的关键，掌握点样技术后再正式点样是获得清晰区带的电泳图谱的重要环节。薄膜浸泡于缓冲液中约30分钟后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸干，平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）， 再在膜条一端2～3厘米处轻轻水平落下并随即提起，使血清完全深透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。
3、电泳
用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸上，点样面朝下，另一端平贴在阳极端支架上。若膜条与电泳方向不平行, 则图谱不整。膜条与滤纸桥之间压严, 使膜条绷直, 中间不下垂。如有很多膜条同时电泳时, 膜条间应相距1～3mm , 使之不互相接触, 以免相互干扰。盖严电泳室,平衡10分钟后方可通电, 否则分离不好。正确连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压160V ，电流强度0.4—0.7mA/cm膜总宽。电泳时间约为25分钟。
4、染色
电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液5～10分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。
5、漂洗 从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入盛有漂洗液的培养皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带，待干。
6、透明
将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3分钟后取出平铺在玻璃板上, 用一直径0.5cm 的玻璃棒将其间的气泡赶出, 两者之间不能有气泡。干燥后此透明薄膜, 区带着色清晰, 可用于光吸收扫描, 长期保存不褪色。
7、定量
将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0．4mol ／NaOH4ml, 于37℃水浴20分钟(不时振荡) ，待颜色脱净即用波长620nm 比色，以空白管调零，读各管吸光度。计算： 吸光度总和(T)=A 清+1A α+2A α+A β+A γ(吸光度)
六、实验预期结果：
血清蛋白组分的相对百分数： 正常值 清蛋白% = A 清/T×100% 54％～73％
α1球蛋白％ = 1A α/T×100% 2.78％～5.1% α2 球蛋白％= 2A α/T×100% 6.3％～10.6% β球蛋白% = A β%/T×100% 5.2%～11% γ球蛋白% = A γ%/T×100% 12.5%～20%
七、实验讨论：
血清变质：条带数会有偏差。
巴比妥溶液PH不合适：影响电泳速率。
漂洗次数过多或时间过长：看不清楚条带。点样没点好浓度不均或者条带模糊
点样没有点好，盖玻片要直直的压在薄膜上，否则血清不均匀，影 响电泳条带形状；
血清不宜过多，若过多则条带过宽，分离不完全； 也不易过少，过少则条带分离不完全
