第一章 绪论
1.1背景简介
1.1.1生物絮凝剂
生物絮凝剂(Bioflocculant) 是利用生物技术, 通过微生物发酵、提取、精制而得到的一种新型、高效、廉价的水处理药剂[ 1 ] 。自从70年代, 日本学者在研究酞酸酯生物降解过程中发现了具有絮凝作用的微生物培养液以来, 日本在生物絮凝剂这一领域的研究工作一直处于遥遥领先的地位。我国关于生物絮凝剂的研究工作只是90年代后才刚刚涉足, 目前仍处于起步阶段。尽管如此, 我国的研究者在这一领域仍然取得了一定的成绩, 并且已经有越来越多的人开始认识到生物絮凝剂的开发潜力及其必要性, 正在积极投入到这方面的工作中, 前景可喜。本文主要从生物絮凝剂产生菌的筛选、生物絮凝剂的分子组成、性质、絮凝机理以及应用等方面对国内外已经和正在研究的生物絮凝剂进行系统全面综述, 并在此基础上对目前生物絮凝剂研究中仍然存在的问题进行了分析论证, 提出可能的解决方案。
1.1.2微生物絮凝剂的优点
① 无二次污染 微生物絮凝剂的主要成分为糖蛋白、粘多糖、纤维素、DNA等高分子物质,具有生物优先降解性,可消除对环境的二次污染。
② 净化效果好 主要是提高对油、无机超微粒子的净化效果并提高脱色效果。目前的除油方法主要是生物除油,一般的化学絮凝剂在不同程度上均可抑制微生物降解作用的发挥。而微生物絮凝剂不但具备絮凝作用,而且具有降解性能,可提高对油的去除效果。日本的研究表明,微生物絮凝剂对畜牧产业废水和瓦厂废水均具有较好的净化效果。同时,微生物絮凝剂对废水的脱色效果也很显著,吴涓等筛选出了具有较高絮凝活性的菌株,该菌株所产絮凝剂对次甲基兰溶液具有很强的脱色能力, 2 min内其对10 mg/L次甲基兰溶液的脱色率达96.9%, 10 min内脱色率可达98%以上,脱色效果优于无机絮凝剂Al2 ( SO4 ) 3 和有机絮凝剂聚丙烯酰胺。
③ 用量少,效率高 同等用量下,微生物絮凝剂的处理效率明显高于传统絮凝剂,且使用少量微生物絮凝剂即可实现大面积污水净化的效果。
④ 安全无毒 小白鼠安全试验证明,微生物絮凝剂完全可用于食品、医药等行的发酵后处理。
1.1.3微生物絮凝剂的发展趋势
尽管微生物絮凝剂有诸多优点，但目前对其研究仍停留在产生菌的分离、筛选和培养上，并未大规模地生产与推广。但它有着广阔的发展前景，其发展趋势主要体现在
⑴ 筛选高产、高效的菌株，并实现其工业化生产，选择替代性培养基，降低成本，并发展适合生物絮凝剂研制与应用的新技术、新工艺。
⑵ 深人研究絮凝剂的理化性质，絮凝活性分布规律、絮凝机理、絮凝动力学和影响絮凝的因素，深化生物絮凝理论基础。
⑶ 根据不同的废水水质研制出具有针对性的高效微生物絮凝剂, 大大降低絮凝剂的投加量。
⑷ 分析出控制微生物絮凝剂产生的基因，利用转基因技术，将其植人来源广、易培养、繁殖快的菌种中，使其大量表达，提高絮凝率。
⑸ 运用原生质体融合和基因工程技术, 创造多功能菌株, 将污染物降解质粒引入到菌种中, 集絮凝、沉降于一身, 大幅度提高微生物絮凝的废水处理能力。 ⑹ 对复合型絮凝剂的研究, 将微生物絮凝剂与其它絮凝剂配合使用, 实现优势互补, 不仅可以提高絮凝率, 而且还可以降低投加量。
1.2国内外对位生物絮凝剂的研究进展
1.2.1国外的研究进展
最早发现的絮凝剂产生菌是美国科学家Butter2field在1935年从活性污泥中筛选出来的菌胶团产生菌。真正深入研究，却始于1976年，J.Naknmura等对能产生絮凝效果的微生物进行了研究。至今发现的具有絮凝性状的微生物种类，有真菌、酵母菌、细菌、藻类等, 由它们产生的微生物絮凝剂类型很多，其中报道最多的主要有酱油曲( Asp ergillus’s sojae ) 产生的 AJ7002 絮凝剂、红平红球菌s-1 ( IZhodococcus ery thvopolis sp- 1)生产的微生物絮凝剂NOC-
1、拟青霉菌 I-1 ( Paecilonu / c es sp.I-1) 产生的微生物絮凝剂PF101等。NOC-1 是目前公认为最好的微生物絮凝剂，能高效地去除猪尿和粪便等，这一研究表明微生物絮凝剂在废水处理方面实用性很强。20 世纪80 年代后期,日本在微生物絮凝剂开发上取得了引人注目的成果。仓根隆一郎等从土壤中筛选到红平红球菌的S21 菌株,并制成了NOC21 微生物絮凝剂。此后,美国、英国、德国、日本、葡萄牙、以色列、韩国、朝鲜、伊朗等国的科学工作者对絮凝剂产生菌和微生物絮凝剂进行了大量的研究工作, 研究发现了一些新的絮凝剂产生菌，其产生的微生物絮凝剂PY-90、AS-10
1、A-9
9、DP-152，其中比较有代表性的是1997年Suh.H.H.等人发现的DP-152 絮凝剂,其首次发现杆状细菌也能产生絮凝剂。2001年,Shih.I.L.等再次发现了一株杆状细菌CCRCl2826 可产絮凝剂,并指出该絮凝剂的分子量2000000,最适环境为中性。2003年, 新加坡国立大学的S.Dent 等从土壤中分离出一株粘质杆状细菌,其研究了该菌产生的MBF A9 的组成特性,其用于处理淀粉废水可使 SS 和 CODCr 分别降低85.5%和 68.5%。来自日本国家人类与生物科学技术研究工业科技机构，他们发现乙醇比葡萄糖和果糖可更有效地产生红平红球菌S-1 絮凝剂。近年来,仓根隆一郎主要研究如何降低NOC21 生产成本,用乙醇作碳源,用豆饼、水产废水和牛血取代酵母膏作氮源,培养基价格下降了2/ 3 以上,而所产絮凝剂的絮凝活性仍然很高。1999年，关于糖类以外微生物絮凝剂生产用碳源的第一篇报道。来自日本国家人类与生物科学技术研究工业科技机构，他们发现乙醇比葡萄糖和果糖可更有效地产生红平红球菌S-1 絮凝剂。国外微生物絮凝剂的商业化生产始于20 世纪90 年代。 1.2.2国内的研究进展
我国对于絮凝剂产生菌及微生物絮凝剂的研究起步晚,从20 世纪90 年代起,国内有关絮凝剂产生菌及微生物絮凝剂的报道日渐多起来了,特别是近几年来我国科学工作者已筛选分离出一些絮凝剂产生菌,有的还进行了培养基、MBF 的制备和应用方面的研究。我国科学工作者在对絮凝基因和转基因的研究方面也做了大量的工作，如中科院微生物研究所的张博润就对酵母絮凝机理研究概况做了论述，何秀萍对絮凝基团FLOI G 的序列作了测定和分析,江南大学的李寅、何宁等研究了新型蛋白聚糖类生物絮凝剂REA 11 的合成途径。微生物絮凝剂的应用方面的研究主要体现在利用微生物絮凝剂治理废水方面，近3 年主要有：林俊岳等利用一株气单胞菌( A eromonas sp.)产生的絮凝剂A-2, 可使洗毛废水的 CODCr 去除率达85%，SS 去除率达88%，水颜色由灰黑色变成红褐液体；黄晓武从生活污水中筛选出霉菌HHE6，其MBF 絮凝率98%，对城市污水处理浊度达88%以上，是一株很有应用前景的絮凝剂产生菌；况金蓉利用筛选菌产生的微生物絮凝剂处理石化废水效果也很好；邹启贤等发现的微生物絮凝剂Xl处理油田外排废水，可使废水的CODCr297 mg/ L 降至 134 mg/ L；尹华等利用微生物絮凝剂产生菌 Az otobacter J25在味精废水中发酵产生絮凝剂对石化废水处理效果最好，COD Cr、SS 及色度的去除率分别为 66.7%、98.3%、93.7%；马放等首次提出了复合型微生物絮凝剂这一概念，即采用廉价底物经过多株菌混合发酵后制得的微生物絮凝剂，并就其对源水的处理效果作了测定；周旭研究了 Pseudo monas sp.GX4-1可以利用多种有机废水生产微生物絮凝剂并着重考察了该菌种在鱼粉废水培养基中合成PSD-1 絮凝剂的基本特性；张晓辉，龚文琪从某水质净化厂的活性污泥中分离筛选出的3 株絮凝剂产生菌，其对高岭土和透辉石加工废水的絮凝效果较好，有可能作为新一代絮凝剂用于建材非金属矿加工废水的处理；卢文玉等研究了内蒙天然碱碱泥絮凝用微生物絮凝剂的最适宜产生条件并利用正交实验得出培养基成分最佳配比。微生物絮凝剂在食品和发酵、医药等方面的应用报道较少，袁其明、张怀经研究分析得出微生物絮凝剂用于低聚木糖脱色的最佳用量；勒艳、白凤武等使用原生质融合技术得到既有良好的发酵性能又具有强的自生絮凝性能的融合株 SPSC,其最适温度 34~ 38℃，耐受最高温度 40℃，最适pH 3.5~ 4.5；李东侠等采用酵母细胞自絮凝形成颗粒作用细胞固定化方法在有效容积1.5 L 小型悬浮床生物发应器中，研究了不同酒精废液循环比条件下的连续发酵供应过程,并探讨了酒精精馏废液全循环的可行性； 陈海昌等利用原生质融合技术培育出了既有较高发酵度又有较强絮凝性的啤酒酵母FP-19等。
但迄今为止,还没有微生物絮凝剂成品出售,基本上仍停留在实验室阶段,并且多数集中在絮凝剂产生菌的筛选研究方面。
1.3实验的目的与意义
从活性污泥中培养并筛选出絮凝剂产生菌，并通过絮凝情况，分析絮凝剂产生菌的性能，掌握性能测试的方法理解絮凝剂絮凝机理。进一步掌握显微镜操作方法的基础上，同时复习革兰氏染色的操作方法。并且通过查找资料了解生物絮凝剂产生菌的有关性能，运用学习过的培养基的配置、分装方法、微生物分离和纯化的原理等知识，在无菌环境下，设计实验，锻炼了我们的动手操作能力，同时也让我们把学过的知识运用到实践中去，达到了学习的目的。
第二章 实验的材料与方法
2.1实验材料
2.1.1实验药品
菌种分离培养基：牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏1.5g，蛋白胨3.0g，NaCl1.5g，琼脂6g，蒸馏水300ml 筛选培养基：发酵培养基：葡萄糖4g，蛋白胨1.2g，酵母膏0.03g，（NH4）2SO4 0.04g,K2HPO4 1.25g,KH2PO4 0.04g,MgSO4 0.04g,NaCl 0.02g,H2O 200ml 高岭土悬浊液（4g/L）：2g高岭土，水500ml，搅匀 2.1.2实验器材
恒温培养箱；分光光度计；高压蒸汽灭菌器；气浴恒温振荡器；超净工作台；酸度计；电子天平；光学显微镜；接种针；酒精灯；加热套；报纸若干张；棉花；线绳；无菌的培养皿5套；移液管1ml1支和10ml1支；洗耳球一个；500ml烧杯1个；锥形瓶300ml 1个和试管6个
2.2实验方法
2.2.1菌种的分离、纯化
利用菌种分离培养基，采用稀释平板法进行分离、纯化，获取单菌落。 2.2.2初筛、复筛
将获得的菌株，用接种环接种于装有筛选培养基的锥形瓶中, 恒温培养 72h , 所得培养液进行絮凝活性的初步测定：在 100mL高岭土悬浊液中, 以几滴菌株发酵液能否使高岭土悬浊液絮凝沉淀及絮凝程度的大小来进行初筛。将初筛所得的有絮凝活性的菌株, 用接种环分别接种于装有 200mL筛选培养基的 250 mL锥形瓶中, 恒温培养 24 h后, 测定培养液对高岭土悬浊液的絮凝活性,从而进行复筛。
2.2.3絮凝活性的测定
在装有4g /L的高岭土悬浊液的 100 mL液体中,加入5mL1%的氯化钙溶液作为助凝剂,再加入2 mL的待测样品，调 pH值至7.5混合搅拌 (快搅1 min,慢搅5 min) ,静置 10min,观察溶液的澄清度。 2.2.4制作载玻片
用革兰氏染色法制作玻片，用显微镜观察菌种类别。
第三章 实验过程与结果
3.1实验过程
12月28日 实验仪器的领取，洗刷，灭菌及培养基的配制与灭菌
12月29日 用10mL移液管移取6管10mL的无菌水。依次编号10- 1, 10- 2,10- 3，10- 4,10-5,10- 6。在无菌操作条件下，用1mL无菌移液管吸取1mL水样置于第一管10mL无菌水中。将移液管吹洗3次，用手摇10min将颗粒状样品打散，即为10- 1浓度的菌液。用1mL无菌移液管吸取1mL浓度为10- 1浓度的菌液于标记为10-2的试管中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10- 2浓度的菌液。同样方法，依次稀释到10- 6。
取 10- 4,10- 5,10- 6，3种稀释度的培养液各1mL于已灭菌的分离培养基各气和一个空白对照,在 30℃下恒温培养48h。配制发酵培养基并灭菌。
12月31日 将纯化后的细菌转接到发酵培养基上，在 30℃下恒温培养72h。 1月 4 日 取出发酵培养基，变浑浊。在烧杯中加入80mL蒸馏水，0.4g高岭土，5mL1%氯化钙溶液，再分别加入2mL含有絮凝菌的发酵培养液。再制作一个空白对照。然后将其分别装入试管内，慢摇4min，静置10min,肉眼观察4只试管上层液的澄清度。
1月 5 日 革兰氏染色，镜检
涂片
取洁净的载玻片，将其在酒精灯上加热，除去油脂。冷却后，与中央部位滴加一滴无菌水，用接种针无菌操作，在斜面上取少量菌水与水混合，烧去环上多余的菌体，并涂成均匀的薄层。
干燥、固定
将涂片正面朝上在酒精灯上方稍微加热。 初染
在载玻片上滴加结晶紫染液1—2滴，1min。 水洗
倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至流下的水为无色为止，干燥。
媒染
碘液媒染1min，水洗，干燥。
脱色
用乙醇脱色20—30s，水洗，干燥。 复染
滴加番红染液2—3min，水洗，干燥。 镜检
先用低倍镜观察，然后用油镜观察。
1月 6日 刷洗仪器，清点上交
3.2实验结果
得到的菌体有较好的絮凝沉降性能。镜检结果为革兰氏阴性菌。
第四章 结论
得到的菌落圆形 ,隆起 ,表面湿润，光滑，用接种环容易将菌体挑起。从发酵培养液中得到的菌体具有较好的絮凝沉降性能，镜检后，发现菌体为革兰氏阴性菌，呈红色。
第五章 个人体会与建议
5.1个人体会
5.1.1活性污泥
活性污泥是活性污泥法处理系统的工作主体，是指由细菌、微型动物为主的微生物与悬浮物质、胶体物质混杂在一起所形成的具有很强吸附分解有机物的能力和良好的沉降性能的絮状体颗粒。污泥中微生物助生长、繁殖、代谢活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了处理状况，同时其中的微型动物一方面具有吞噬废水中有机颗粒和游离细菌的能力，可促进菌胶团的形成，对废水净化起一定作用，另一方面，微型动物在某种程度上可反映出废水水质和处理效果，可作为废水处理的指示生物。 5.1.2灭菌
灭菌是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢、孢子。灭菌方法有很多，有加热，过滤，照射和化学药品等。湿热灭菌中的高压蒸汽灭菌是将带灭菌的物体放有一个密闭的加压灭菌锅内，产生蒸汽导致菌体蛋白质凝固变性而起到灭菌的目的。一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固。二是湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。三是湿热灭菌的蒸汽有潜力存在。 5.1.3培养基的配制
培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工的方法配制而成的一种基质。
固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基，常用固体培养基有琼脂、明胶、硅胶（用于配制自养微生物）；对于其它多数微生物来讲，琼脂最为合适，一般加入1.5%—2.5%即可凝固成固体，如牛肉膏蛋白胨培养基等。此培养基可供微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等。
液体培养基：不加任何凝固剂配好后成为液体的培养基。如糖发酵液体培养基、蛋白胨水培养基等。常用于大规模的工业发酵生产、遗传学研究、生理代谢等基本理论的研究工作。 5.1.4革兰氏染色
革兰氏染色的基本步骤是：先是初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媚染，然后用乙醇脱色，最后用复染剂复染。
经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌，如果细胞中初染剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法之所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是有这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增加了燃料与细菌的结合力，当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，是肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色，革兰氏阴性菌不同，由于其肽聚糖层较薄，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 所以这一过程中最重要的环节就是乙醇的脱色，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，所以脱色时间一般问20-30s，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上的水洗净。 染色前固定细菌有两个目的：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上，二是增加其对染料的亲和力，本实验用的方法是加热法。
5.2建议
在条件允许的情况下增加类似的可以自主设计独立完成的实验课程，可以使我们更好的将课本知识与实际操作结合起来。
