体外肿瘤药敏试验方法研究进展
甘萍
治疗肿瘤的方法主要有3种，包括肿瘤化疗、放疗、手术。其中肿瘤化疗在消灭微小肿瘤转移灶和手术切除后的残留肿瘤细胞治疗中有着手术与放疗无法达到的显著优势，但肿瘤化疗中仍有许多问题：①肿瘤病人个体间对化疗药物敏感性差异大；②肿瘤对化疗药物有耐药性；③化疗药物对许多类型的肿瘤特别是实体瘤的有效率不高；④化疗药物的选择性差，毒性大，杀伤癌细胞的同时也杀伤正常细胞，给病人机体造成较大的损害。对于上述出现各种问题在临床上经验的化疗用药是无法保证肿瘤患者的个体有效性，因此个体化化疗在临床肿瘤化疗中就显得尤为重要。目前公认的较好的方法就是做肿瘤化疗药物敏感性试验(简称肿瘤药敏)，该方法的特点是直接从患者体内获取新鲜的肿瘤组织进行首次培养，由于肿瘤细胞刚刚离体，生物学性状尚未发生大的变化，能较真实地反映整个肿瘤细胞群体的特性及不同供体的个体差异，能够比较确切地代表体内状态，为不同的病人准确筛选敏感的化疗药物,并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药，以提高化疗的靶向性，减少化疗药物的不良反应，降低细胞耐药性，成为肿瘤治疗中迫切需要解决的问题。
目前，预测肿瘤药敏的方法已发展为体内和体外两大系列20多种药敏试验，并不断地朝着简单、快速、敏感、筛选作用方式不同的药物与临床有良好的相关性的方向迈进。而本文针对体外肿瘤药敏试验方法进行综述。
1 人体肿瘤细胞集落测定(HTCA) 它是利用肿瘤细胞悬液，置于双层琼脂中培养，通过选择性加入化疗药物培养后，计数细胞繁殖形成的集落数目，再评估肿瘤细胞对该药的敏感性。该法的优点：敏感、直接评价细胞增殖死亡。缺点：用于临床标本检测率低、周期长、集落计数繁琐。
2 放射性标记代谢物前体掺入法(3H-Tdr aay) 该法利用氚标记的胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶作为核酸代谢物前体，测定一定时间内放射性标记的代谢物前体掺入的多少来判断药物对细胞增殖活性的抑制作用。该法的优点：操作简便、所需时间短、灵敏度高、重复性好，临床相关性与集落形成法相近，可适用于绝大多数恶性肿瘤。缺点：存在放射性污染，只能用于标记指数>5%的样品，显然无法测出药物对G0期细胞的杀灭作用，而且胸腺嘧啶池的大小也可影响结果，故标记指数的变化不一定系抗癌药所致。此外，同位素的放射性也限制了它的应用。
3 快速荧光分析法(FMCA) 它是采用一些特殊的荧光染料(荧光素二乙酸酯)对细胞的特定成分进行染色或标记，或者通过细胞酶使无荧光性的材料分解或换成荧光材料，通过测定荧光强度而测出活细胞数量。活细胞中水解酶可将双醋酸根荧光素水解为荧光素发出荧光，测定荧光的强度可反映培养体系中活细胞的数目。该方法的优点在于：成功率为80%~95%。细胞用量小，半自动的终点测定法利于多种药物不同浓度的检测，尤其对于乳腺癌及易污染的胃肠道癌症的体外药敏成功率高；测定范围宽，细胞数在102～105之间时，荧光强度(F1)与活细胞数都能呈很好的线性关系；荧光分析法毒性低，能重复测定并可区分恶性肿瘤细胞和正常细胞，使临床抗肿瘤药物得以定量监测；荧光分析法重现性好，此法所依赖的水解酶一般比较稳定。缺点是：仪器要求高，且需专业人员操作；由于荧光猝灭现象存在，使测定过程变得复杂。
4 MTT比色法
四甲基偶氮唑盐(methyl-thiazolyl tetrazolium，MTT)可被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色的甲臜(formazan)，甲臜的形成量与细胞的活力成正比，用比色法测定甲臜的量以判断药物对肿瘤细胞的杀伤程度。该法特点：①简便；②快捷，1周内可完成；③经济，临床应用广；④测定结果反映了所有的肿瘤细胞(增殖期及静止期)，适用于所有肿瘤类型；⑤与临床相关性好；⑥所需样本量适中(1×105～5×105个细胞/孔)；⑦为肿瘤药敏的常规方法。缺点：甲臜结晶的溶解度差。且检测到的是活细胞，不能区分正常细胞和肿瘤细胞，因此当应用于高度不均一的临床肿瘤组织时，难以准确反映药敏结果；所需细胞数较多，所测数据变异较大(抑制率分析变异系数在23 % ～30 % )，结果不稳定。
5 三磷酸腺苷法(ATP) 三磷酸腺苷(ATP)是活细胞代谢的主要能量来源，细胞死亡时，ATP在酶的作用下迅速水解，因此活细胞中ATP含量较死亡细胞含量高，通过测定癌细胞内ATP水平，了解抗癌药物敏感度。优点：重复性好，成功率可达90%~96%。ATP法能体现药物对整个肿瘤细胞群的杀伤作用，试验周期较短，所需细胞数量少、快速、简便，是一种很有前景的体外药敏试验。同时也适用于G0期细胞药敏分析。缺点：测定仪器昂贵(约15万元)、无法排除非癌细胞干扰等。
6 染料排斥法(又名：区别染色细胞法differential staining cytotoxicity aay, DISC) 该法利用快绿使短期培养(4 d)的死细胞着色，同时加入鸭红细胞作为内计数标准，以药物处理组与对照组残存肿瘤细胞的比值作为评价药物敏感性的指标，以残存肿瘤细胞小于50 %作为体外敏感的界限。该法最大优点：所需时间短(5 d)，易被临床所接受。另外，细胞用量少，有利于悬浮细胞存活率的测定。缺点：细胞计数繁琐，有些淡染细胞不易区分死活，染色时间要求准确，稍长则活细胞也染色，故敏感性较差。
7 胶原凝胶液滴植入培养法(collagen dropletem bedded drug sensitivity test, CD-DST) 本法是将癌细胞包埋于人工的细胞外基质即胶原凝胶滴中进行三维立体培养，使其在接近人体生理状态的环境中对抗癌药物的敏感性进行定量分析。该法优点：所需样本量小，癌细胞培养成功率高、药敏试验结果准确、可以除去混入的成纤维细胞的影响及可反映患者对不同抗肿瘤药物敏感性的差异，对抗肿瘤药物的体外筛选和对个体化治疗具有实际应用价值。缺点：该法价格较贵，目前仅在日本广泛应用。
8 流式细胞仪法
其原理：利用流式细胞术检测发生细胞凋亡的细胞数以及逃脱凋亡细胞中DNA损伤的程度。该法通过检测出细胞经药物作用后良好线性的剂量-效应关系，可以测得药物的协同作用，被认为能用于白血病和淋巴瘤的药敏试验中。优点：该法迅速简便，所需细胞数较少。缺点：仪器昂贵，技术要求较高，使其临床应用受到一定限制，临床应用报道不多。
9 细胞凋亡法(TUNEL)
其原理为化疗药物对卵巢癌细胞的作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的，通过计数细胞凋亡数目，判断肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度。邱潮林等用细胞凋亡法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)和MTT法在体外对白血病细胞株细胞、肝癌腹水中肿瘤细胞及实体瘤中分离出的肿瘤细胞对8种化疗药物的敏感性进行了检测。TUNEL和MTT法对白血病细胞株所测得的结果高度一致；对肝癌腹水中肿瘤细胞的药敏两法所得结果基本一致，而对实体瘤中分离出的肿瘤细胞同时用两法检测药敏的实验结果有较大差异，统计分析表明TUNEL优于MTT法。提示在细胞高度均一时(如白血病细胞株细胞)，TUNEL和MTT法均可准确反映药敏情况，而随着所分离的肿瘤细胞纯度降低，MTT法难以准确反映药敏实验结果。表明TUNEL法由于可直接在荧光显微镜下观察发生凋亡的肿瘤细胞，所以可减少混杂的组织细胞对结果的干扰。
10 嗜银蛋白染色法
核仁组织区嗜银染色技术(silver-staining nucleolar organizer regions, AgNOR)，多用于肿瘤病理学的诊断和研究，但近年来，已有应用AgNOR研究肿瘤细胞对抗癌药物敏感性的预测。AgNOR是通过形态学方法来反映细胞增殖活跃情况，化疗药物的作用机制是通过多种途径作用于恶性肿瘤细胞，最终达到抑制癌细胞分裂增殖的目的，所以对抗癌药物敏感的肿瘤细胞AgNOR颗粒数应减少。AgNOR所得结果与MTT法所得结果得符合率为89%。张丽萍等应用人肺腺癌细胞(human lung adenocarcinoma cells, SPC-A1)等3株人体肿瘤细胞株，以MTT法及嗜银蛋白染色法，对长春新碱等6种化疗药物的敏感性进行了研究。结果发现两种方法有良好的符合率，且后一种方法经济、简便，可排除非肿瘤细胞的干扰，弥补了前一方法之不足。
11 乳酸脱氢酶检测
抗癌药物与肿瘤细胞作用后，可使肿瘤细胞死亡溶解，细胞溶解以后，将释放一些释放物可使患者造成外周血中乳酸脱氢酶明显增高，所以乳酸脱氢酶可作为肿瘤化疗敏感指标。丘仑兴等用集落形成试验、MTT吸收光度法和乳酸脱氢酶测定3种方法检测5种常用抗肿瘤药物：多柔比星、氟尿嘧啶、丝裂霉素、长春新碱和甲氨蝶呤对人宫颈癌HeLa细胞系的细胞毒作用。显示3种方法的检测结果有良好的相关性，均以多柔比星和丝裂霉素最有效。在这3种方法中，以集落形成试验最敏感；MTT法成功率高，适用于临床选择有效的化疗药物；而用药后乳酸脱氢酶值的升高则是化疗有效的可靠指标。
11 端粒酶活性法
端粒酶是目前已知的最为广谱的恶性肿瘤分子标志物，几乎在各种人类恶性肿瘤中均有不同程度的表达，而在正常细胞中基本无表达，Kim等创立了聚合酶链反应-端粒酶重复扩增法，能在大量正常细胞中探及1～10个恶性肿瘤细胞的端粒酶活性，并证实了恶性肿瘤细胞在一定数量范围内与端粒酶活性呈线性关系。据上述事实可以设想，可通过检测恶性肿瘤细胞体外经抗癌药物治疗后残留的端粒酶活性，作为判断肿瘤药敏的新的指标。
1999年，Faraon首先用聚合酶链反应-端粒重复扩增法测定50例恶性肿瘤标本对抗癌药的体外敏感试验，证实此方法有较高的敏感性和重复性，由于只能检测出恶性肿瘤细胞活性，故从理论角度来说较大地提高了测定结果的准确性。但需长时间聚丙烯凝胶电泳，放射自显影后进行扫描的方式分析显示扩增的6 bp梯度条带，故定量困难、检测时间长、需要同位素。目前改良的聚合酶链反应-端粒重复扩增-酶联免疫吸附(PCR-TRAP-ELISA)法测定肿瘤药敏可克服这些缺点，简称此方法为端粒酶活性法。翟晓波等提出端粒酶活性法敏感度远高于MTT法。优点：可以区分正常细胞和肿瘤细胞；灵敏度极高，可以检测出1～10个肿瘤细胞；可以应用于穿刺、活检标本,适应临床需要。缺点：成本高，技术要求高，结果不稳定(PCR扩增容易出现假阳性)，目前报道较少，缺乏大量临床验证。
12 TECIA法
本法由江苏先声药物研究院首创，采用体外肿瘤组织块培养，通过分析给药前和给药后肿瘤组织面积的改变，获得多种单药或联合用药的肿瘤生长抑制率，从而为临床确定用药方案提供参考依据，TECIA法是在最接近在体状态的体外药敏试验。国内学者报道，与传统的单细胞培养MTT肿瘤药敏试验法相比，TECIA法具有简单易行、标本需量少、成功率和临床符合率高的优点。
13 总蛋白染色法(sulforhodamine B potein stain aay，SRB法) SRB是一种蛋白质染料，可与经三氯乙酸固定后的细胞蛋白的碱性氨基酸作用而显粉红色，在515nm的吸收读数与细胞数呈良好的线性关系。1990年由Philup Skehan创立此法，随后即被美国癌症研究所列为常规抗肿瘤药物的筛选方法；1997年Papaazisis对此稍作改动，使其变异系数小，线性增强。有研究认为该法比MTT法更灵敏(每孔仅150个细胞)，培养时间更短。
14 慧星试验(comet aay) Ostling利用DNA的碱基对可被强碱破坏，DNA的损坏表现为电泳条带的不连续性的原理于1984年建立该方法，被广泛应用于基因毒理学。本法快速、敏感，血液学肿瘤成功率为85%，固体肿瘤的成功率为60%，但不适用于破坏DNA的药物。
15 二甲氧唑黄比色法(XTT colorimetric aay, XTT)
MTT法形成的甲臜产物不溶于水，为使其溶解所加的有机溶剂因具有挥发性，可对实验者及设备产生损害。Paull等在1988年合成出可产生水溶性甲的化合物XTT。XTT是一种与MTT类似的四氮唑衍生物，操作方法基本相同，不同的是加XTT的同时，需加电子耦合剂酚嗪硫酸甲酯，这样才能产生足够的水溶性甲物质，并且要现配现用。
吴楠等采用XTT体外细胞增殖和药敏检测，所得出的细胞生长曲线与MTT法结果相似，实验结果显示XTT产生的甲臜物质高于MTT，并且实验时间短，步骤简便，认为XTT法优于MTT法。
16 细胞团法
经机械的和酶消化后的细胞团仍能保留其体内主要结构和某些功能，在一定的条件下具有与其体内相近的增殖特征。当化疗药物暴露于瘤细胞团块培养后48 h，通过检测细胞的形态学来反映药物敏感性。
17 三维立体组织培养法(histoculture drug response aay, HDRA)
由Hoffman在1991年建立。该方法的基本原理是将肿瘤以组织块的形式在体外培养并加入化疗药物，观察组织块对不同化疗药物的敏感性。此方法的建立基于以下观点：单层的平面生长不利于细胞形态的展现，影响了细胞结构的完整性；结构完整性的丧失，又影响了瘤细胞的一些特异性表达；体外药敏试验缺乏体内的代谢环境；缺乏体内瘤细胞之间的相互联系。因此，将单层细胞培养改为组织块或多细胞球体培养，能够保持实体瘤在体内的三维生长方式、组织结构、细胞异质性等多种特性，模拟体内实体瘤内细胞的环境，会更加接近体内组织情况，与临床实际情况更为接近。
较早是采用3H-thymidine渗入法，现多采用MTT法观察组织块对化疗药物的敏感度。并引入计算机图像分析技术，形成组织块培养-终点染色-计算机图像分析法( tiue culture-end point staining-computer image analysis, TECIA)，进一步简化了实验步骤。优点：操作简便；成本低；可以模拟体内实体瘤环境；非常适用于临床应用。缺点：不同肿瘤细胞的选择性培养有困难。
18 极端耐药试验(extreme drug resistance aay, EDR aay)
肿瘤药敏试验结果的阳性预测值往往远低于其预测耐药的准确性，通过体外药敏试验辨别不敏感的化疗药物，可以减少不必要的毒性反应、避免耐药性的产生。EDR aay是将肿瘤细胞植入软琼脂中培养，并长时间暴露于高浓度的化疗药物[血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)为体内的5～80倍]。通过与阴性对照组比较，计算出个体的肿瘤细胞抑制百分率(percentage cell inhibition, PCI)。基于既往的耐药性检测结果，得出各化疗药物人群PCI的中位数(M)和标准差(SD)。按个体肿瘤细胞的PCI>M、PCI介于M与M-1SD之间和PCI
19 Chem oFx aay
体外培养的活肿瘤细胞贴壁生长，受药物作用后凋亡或死细胞由于细胞挛缩、细胞膜完整性破坏而从培养基上脱落。基于上述原理，Precision Therapeutics公司于1996年开发出用于预测肿瘤化疗敏感度的Chem oFx aay。该试验通过将组织块在体外原代培养后获得足够数量的肿瘤细胞，经胰蛋白酶作用后，将特定数量的肿瘤细胞种入微孔板中培育，细胞贴壁生长。加入6种不同浓度的化疗药物作用一定的时间后，经冲洗、固定，移去死亡、不贴壁的细胞。贴壁留下的活细胞经核荧光染色后，通过自动显微镜图像分析系统计数，得出每种药物不同浓度的细胞存活率，并设阴性对照。数据汇总后，得出每种药物的剂量-反应曲线。Chem oFx aay的特点是(1)检验所需样本量小：实体肿瘤仅需35 mg组织，液体标本仅需40 mL，可用于穿刺活检及恶性胸腔积液和腹水等标本的检验。(2)检验药物的范围广，还可用于生物制剂的检验。(3)可对单药或最高三药联合的方案进行检验。(4)该检验中所使用的不同的药物浓度包括了体内肿瘤细胞暴露的药物浓度，检验结果对临床药物使用更具有指导意义。目前，Chem oFx aay可用于各种实体肿瘤的化疗敏感度检验,但尚未应用于血液肿瘤及淋巴瘤的检验。Mi等报道，Chem oFx aay对乳腺癌患者检测的成功率83.9%，可重复性高(变异系数
20 琥珀酸脱氢酶抑制法(Succinate Dehydrogenase Inhibition Test, SDI) 该法细胞内三竣酸循环中有关合成ATP的重要酶类之一。1960年DalIner等人首次应用琥珀酸脱氢酶活性指标作为判断肿瘤细胞活性，当时酶活性测定使用氯化三苯四氮唑(TTC)作显色剂，寻敏度不高。1980年日本学者齐藤等人改用3(4,5-二甲-2-唾哇)-2,5-二苯一溴化四氮唑(MTT)，灵敏度提高了10倍。目前所用的即为改良SDI法。MTT无色，当接受唬拍酸脱下的氢后，即还原成紫红色的甲臜(formazan)，甲臜的生成量与活细胞数成正比，加入三氯醋酸溶剂停止反应，并溶出甲臜用分光光度计测定光密度，可用颜色深浅反映活细胞的多少。癌细胞受药物抑制则SD活性降低，紫红色较浅。
该法特点：试验简单、快速、灵敏、取材少、半自动、重复性好，是一种很有发展前途的体外恶性肿瘤药敏试验方法。且SDI试验不仅用于单个药物的敏感性测定，而且可用于不同稀释度化疗药物混合后同一条件下培养的联合使用及不同疗法的敏感性侧定。
21 梯度离心法
梯度离心法是分离细胞常用的方法。其基本的原理：细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。梯度离心法本身不需要复杂的仪器设备，操作简单、可靠。
22 Patient-Derived Xeugraft(PDX)法
鉴于目前广泛采用的实验动物细胞接种模拟肿瘤在体实验方法，美国西北医院Wenan Qiang ph.D 提出PDX肿瘤药效评价方法，并在课题组中的药物开发与肿瘤治疗研究中得到应用。出于现行细胞接种方法的弊端：细胞在体成瘤后（实验动物）的药敏结果并不等价于药物对患者有效，致使不少临床前有较好药效的药物惨遭临床淘汰原代培养的肿瘤细胞传代后大多数被淘汰，致使细胞的代表性减弱，PDX法采用患者肿瘤直接取样接种于实验动物体内，模拟人体实验环境（如，卵巢癌组织接种于实验动物卵巢膜下），培养观察，再通过实验动物实体瘤传代扩大培养用于药敏实验，实验结果更具代表性，对于患者能提供更直接的药效结果，便于临床治疗。但该法目前未广泛采用，技术难度较大成本相对较高。
23 总结 综上所述，其中有些方法由于存在明显缺点，目前已很少使用。如放射性标记核酸前体掺入法需要使用放射性同位素，无法测出药物对G0期细胞的杀灭作用(G0期细胞不进行DNA合成)；集落形成法需要细胞量大、试验周期长、工作量大、成功率低；荧光细胞印迹法技术难度大，难于推广；核形法需要有经验的病理学家判断结果，而且费时耗力、指标不够客观等。另外一些方法文献报道极少，难以判断其优劣。且由于肿瘤的恶性性质及目前肿瘤治疗的现状，医生和病人均希望有能够准确预测化疗药物敏感性的方法，能否与临床实际相符合是医生考虑的首要因素，价格、操作难易程度、需要的时间也在考虑范围之内。有少数文章对其中某些方法进行了比较，总体说来，后建立的方法优于早期方法(三维组织培养、ATP-TCA法优于MTT法，MTT法优于其他更早期的方法)，肿瘤药敏测定正在不断完善与提高。随着人民生活水平的提高，及对癌症治疗的要求越来越高，肿瘤药敏测定将有着良好的临床应用前景。
