血球分析仪基本原理
血球分析仪是用来测量血细胞(RBC、WBC、PLT等)数量;测定血细胞的Hb浓度,对白细胞(WBC)进行分类并通过计算给出血细胞参数(HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW、PCT、PDW等)的自动化仪器。它是临床检验科室使用率最高的必备的常规装备之一。选择一台功能完善,质优价廉的血球分析仪对医院的临床工作具有极其重要的意义,了解血球分析仪的基本原理及购置时的技术评估要点是搞好仪器选型工作的基础。
一、血球分析仪的基本原理
早在50年代初,美国的W#H#Coulter就对血细胞的计数方法进行了卓有成效的研究,发明了利用电阻法计数血细胞的技术,人们称之为库尔特原理。是在计数管内外各置一支铂金电极,两电极间施加一个恒定的电流,测试时先将待测血用洁净的电解液充分稀释,使血细胞在电解液中成为游散状态,然后在计数管上端施以负压,利用血细胞经过计数管宝石孔(管内、外的唯一通道)时的电阻改变而获得电脉冲,脉冲数代表血细胞个数,从而达到计数的目的。
1.1红细胞(RBC)和血小板(PLT)的测定和识别适当稀释的全血细胞(大量的是PLT和RBC)经过计数管宝石孔时,血小板体积较小,对孔电流的阻碍小,形成的电脉冲小;红细胞较大,形成的脉冲较大。在计数红细胞时,利用一个脉冲幅度甄别器,将幅度较小的血小板脉冲去掉,保留红细胞和白细胞脉冲,因血液中白细胞的数量不足红细胞的1/500,故其总数可认为是红细胞计数。在计数血小板时,将脉冲幅度甄别器的阈值调低,计出血小板的总数,再减去红细胞的计数,剩下的即为血小板数。
2.1白细胞(WBC)的测定和分类
(1)/三分类0分析仪的分类方法在计数白细胞(WBC)时,利用溶血剂使红细胞(RBC)溶解,再对剩下的白细胞计数,由于溶血剂可使白细胞的胞浆发生绕核皱缩,白细胞的体积变小,淋巴细胞(Lym)约为35~90fL。包括正常和异常淋巴细胞;中间细胞(MID)约为90~160fL,包括单核细胞(Mon),嗜酸(Eos)和嗜碱(Bas)性细胞以及原始和早期的粒细胞;中性粒细胞(Neu)由于胞浆中的颗粒被压在核周围,比其他细胞都大,约为160~450fL。这些细胞在经过计数宝石孔时形成的电脉大小不同,从而可推知细胞的大小和类别。电阻法是通过测量细胞的大小进行血细胞的分类计数,只能对白细胞进行/三分类0,即分成淋巴细胞、中间细胞和中性粒细胞。这种简单的分类方法只适用于血常规检查和作规模较大的过筛检查,要进行更细致的分类有赖于新的检测技术。
(2)/五分类0分析仪的分类方法单独使用电阻法的最大问题是中间细胞(MID)无法进一步区分。从80年代中期开始,对白细胞的分类从/三分类0发展到/五分类0,即可以分成淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和中性粒细胞。进入90年代,高档的分析仪还可以检测出幼稚细胞和T淋巴细胞,能对细胞进行免疫分型,能进行网织红细胞计数。目前可进行/五分类0的高档分析仪的检测技术有四种,即电阻抗、高频电导和激光散射联合检测法;电阻抗和射频电导联合检测法;激光散射和细胞化学染色联合检测法,以及多角度激光偏振光散射检测法。
a、电阻抗、高频电导和激光散射联合检测法亦即VCS (Volume, Conduetivity, Light Scatter)技术。电阻法可检测不同体积的细胞,但不能区分体积相同的细胞,使用高频电导法和激光散射法可以弥补这一缺陷。细胞壁对低频电流产生很高的阻抗,但能通过高频电流;而细胞核的大小不同和细胞器不同,细胞内颗粒的大小和密度不同,它们对高频电流的阻抗也不同,因此可以用来区分白细胞。激光散射技术主要用来检测细胞表面及内部颗粒的结构差异。激光散射对细胞颗粒的构型和密度的区别能力强,粗颗粒产生的光散射比细颗粒强,可以借此将粒细胞区分开。
b、电阻抗和射频电导联合检测法在细胞悬浮液中加入溶血剂使红细胞溶解,对白细胞进行电阻抗法(测量细胞体积)和射频电导法(检测细胞核和颗粒密度)的联合检测,从而将白细胞分成淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个群体。在细胞悬浮液中加入特异的溶血剂(检测嗜酸性细胞的系统加入Stromatolyzer-EO),检测嗜碱性细胞的系统加入Stromatolyzer-BA),使嗜酸性细胞或嗜碱性细胞以外的所有细胞溶解或萎缩,再对保持完整的嗜酸性细胞或嗜碱性细胞进行计数。以硫化氨基酸与幼稚细胞结合而使之不被溶血剂溶解,还可对幼稚细胞进行计数和初步分类。
c、激光散射和细胞化学染色联合检测法这种技术是利用激光散射和过氧化物酶染色技术进行细胞分类。以过氧化氢酶染色技术使嗜酸性细胞强染色,中性粒细胞次强染色,单核细胞着色,而淋巴细胞和嗜碱性粒细胞不着色;以单抗使T细胞着色而非T的淋巴细胞不着色,借助于对着色强度和激光散射的检测并结合特异性溶血剂,不仅可对白细胞分类,还可检出异常白细胞。
d、多角度激光偏振光散射检测法仪器同时从四个角度测量通过激光束的细胞所产生的散射光, 0b前角光散射检测细胞的体积,10b狭角光散射用来测定细胞结构的复杂性, 90b垂直光散射对细胞内部颗粒及细胞质量进行测量,90b消偏振光散射将嗜酸性细胞从中性粒细胞和其它细胞中分离出来。
3.1血红蛋白(Hb)的测定用溶血剂将经过稀释的血液中的红细胞破坏,血红蛋白便溶解出来。在被溶解出来的血红蛋白中加入转化剂(一般用氰化钾),使之形成颜色稳定的氰化血红蛋白,再通过比色法测得血红蛋白的含量。
二、血球分析仪的防堵办法由于血液成份的污染,计数宝石孔很容易阻塞,通常仪器采用下列方法防堵: (1)高压瞬时沸腾电路去除孔内的有机物; (2)每做一次标本后,以稀释液反冲一次,冲去污染物; (3)操作者定期用清洁液清洗,做好保养维护。
三、血球分析仪购置选型时的技术评估要点
(1)仪器的档次、测试速度、自动化程度
(2)重复性和稳定性对同一标本或质控物(高、中、低值)进行批内或批间的重复检测,观察RBC、PLT、WBC的计数结果, Hb的测定结果及WBC的分类结果,计算CV值,与仪器说明书中质量保证的CV值比较,应符合质量标准。其中PLT是敏感指标, PLT在20g/1时的CV值很能反映仪器的计数性能。仪器长时间开机的稳定性以及对室温的适应性亦是重要的观察指标。
(3)机器的线性范围将血样浓缩并用稀释液稀释成不同浓度,使其最低值和最高值均能含盖生理和病理范围。用仪器进行测定,以稀释度为横坐标,以测定值为纵坐标,计算并绘制回归直线。各数值点应基本在直线上,相关良好,特别要注意直线两端各点的相关性。
(4) WBC分类结果与镜检分类的一致性
(5)防污染性能取高值标本连续检测(RBC、WBC、PLT和Hb)三次(A
1、A
2、A3),接着再取低值标本连续检测三次(B
1、B
2、B3),按下式计算:携带污染率=B1)B3A3)B3@100%携带污染率应越低越好。
(6)采样针的清洗情况以滤纸擦拭仪器自动清洗过的采样针,应无肉眼可见的红色血痕。
(7)防堵性能仪器最好同时具有沸腾电路和反冲功能,在正确维护的情况下,正常使用时,应无堵塞情况发生。
(8)软件水平好的血球计数仪其资料存储量要大,要能Lev-erg jenning图质控分析和X)B分析;要能在打印结果时提供正常值;对异常标本和异常项目能报警并具解释或提示功能;打印报告的形式具有可编排性;尽量避免热敏打印。
