植物基因组DNA提取
一、实验目的
1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。
2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。
三、实验仪器及试剂
实验仪器:高速离心机;烘箱;冰箱;水浴锅;高压灭菌锅;Nanodrop。
实验试剂:玻璃珠,十二烷基磺酸钠(SDS);三羟甲基氨基甲烷(Tris);乙二胺四乙酸(EDTA);氯化钠;苯酚;氯仿;无水乙醇等。
四、实验步骤
1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。
2.将叶片置于1.5ml离心管中,液氮速冻,组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液,涡旋摇匀。
4.置于65℃的水浴中,每隔10 min轻轻摇动,30 min后取出。 5.加入200 l KAc溶液,摇匀,放入-20℃冰箱30 min。
6.10000 rpm离心5 min,上清移至新离心管中,12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中,加入700 l异丙醇, -20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min,弃上清,加入500 l 70%乙醇漂洗。 9.弃液体,晾干。
10.DNA纯度与浓度测定 (使用nanodrop)。
(1)DNA纯度:DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。
OD260/OD280 1.8:说明较纯;
OD260/OD280 1.8:说明可能有RNA污染;
OD260/OD280 1.8:说明可能有蛋白质污染。
五、注意事项
1.叶片磨得越细越好。 2.注意移液器的正确使用。
3.由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。
六、结果与分析
1.植物DNA提取所用试剂的作用? 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些? 3.植物DNA提取后的用途有哪些?
4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。