1.生物药物：又称为生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其它基础学科的科学原
理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的技术。
2.生物技术药物： 采用DNA重组技术或其它生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白和
核酸类药物，如细胞因子、纤溶酶原激活剂、血浆因子等。
3.质粒载体：质粒是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。分三种构型：共价闭合环状
DNA(cccDNA)、开环DNA(ocDNA)、线状DNA(IDDNA)。在琼脂糖凝胶电泳中迁移率：cccDNA > IDDNA > ocDNA
4.目的基因的常用制备方法主要包括化学合成法、PCR法、基因文库法和cDNA文库法等。
5.PCR法是指聚合酶链反应，是根据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模
板特异性的扩增DNA。在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的缓冲溶液中通过三个循环步骤扩增DNA：：①变性—双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；②退火—温度下降，引物与单链模板结合（温度下降，PCR特性下降，效率升高）；③延伸—温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3′-OH，引物以5′→3′方向延伸，最终与单链模板形成双联DNA, 并开始下一个循环。
6.cDNA文库法：cDNA是指与mRNA互补的DNA。cDNA文库法是指提取生物体总mRNA，并以mRNA作为模板，
在逆转录酶的催化下合成cDNA的一条链，再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，将全部cDNA都克隆到宿主细胞而构建成cDNA文库。
7.影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：
①DNA片段之间的连接方式；粘性末端的连接效率高于平头末端。
②目的基因与载体的浓度和比例；增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因于载体DNA的摩尔数比应大于1。 ③连接温度，时间，连接酶的活性及缓冲体系。
8.重组DNA导入宿主细胞的方法：转化、转染、显微注射和电穿孔。
9.互补筛选法（最常见蓝白班筛选法）需添加X–gal（X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈蓝
色）和IPTG（是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质）筛选物质进行筛选。
10.菌落原位杂交：又称探针原位杂交法，制备与目的的基因某一区域同源的探针序列，根据核酸杂交原理，探针序列
特异性地杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位监测。
11.凝胶过滤层析：凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法。基本原理是：根据生物
大分子的蛋白质的质量的大小来实现目的蛋白的分离纯化。在凝胶过滤层析中所用的凝胶是一种惰性的不带电荷具有三维空间结构的多孔网状物质，凝胶的每个颗粒的微粒结构就如一个筛子，当样品随流动相经过凝胶柱时，较大的分子内不能进入凝胶网孔内而收到排阻，将与流动相一起首先被洗脱下来，而较小的分子进入部分凝胶网孔内，所以流出的速度相对较慢。
12.反相层析（RPC）和疏水层析（HIC）的比较：是根据蛋白质疏水性差异来实现分离纯化。先比反相层析而言，疏
水层析回收率较高，蛋白质变性的可能性较小。反相层析和疏水层析的差异在于前者在有机相中进行，蛋白质经过反向流动相与固定相作用有时会发生部分变性，而后者通常在水溶液中进行，蛋白质在分离过程中一般仍保持其天然构象。
13.蛋白质含量测定方法：紫外吸收法、BCA法、福林—酚试剂法（lowry）、考马斯亮蓝法、ELISA法等。
14.蛋白质纯度检查的常见方法：SDS-PAGE法（最常用）、非变性PAGE法、层析法等。
15.蛋白质序列的分析方法：N-端氨基酸序列分析法（基本原理Edman法）、C-端氨基酸序列分析法。
16.体外培养动物细胞的类型：贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞。
17.动物细胞与微生物细胞，植物细胞相比较具有的特点：
①比微生物细胞大得多，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差
②倍增时间长生长缓慢，正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
③对培养基的要求高，易受微生物污染，培养时常常需要添加抗生素
④生长大多需贴附于基质，相互黏连以集群形式存在，并有接触抑制现象
⑤多半将产物分泌在细胞外，便于收集和纯化。
18.动物细胞的营养要求是：1.碳源不能为无机物，大多为葡萄糖
2.氮源也不能为无机物，主要为各种氨基酸
3.在很多情况下尚需添加5%-20%的小牛血清或适量的动物胚胎浸出液
19.动物培养基可分为：天然培养基，合成培养基和无血清培养基三大类.
20.原代细胞：直接将动物组织或器官经过粉碎，消化而制的的悬浮细胞称为原代细胞.
21.悬浮培养法：是细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方法，它适用于一切种类的非贴壁细胞，兼性贴壁细胞，
可连续测定细胞浓度，连续收集部分细胞进行继代培养，也无需消化分散，细胞收率高
22.木瓜蛋白酶水解IgG分子可产生两个抗原结合片段（Fab）和一个可结晶片段（Fc）
23.胃蛋白酶水解IgG分子可产生一个F(ab’)2和若干裂解小分子片段（pFc’）
24..单克隆抗体技术的基本原理：基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞与B细胞的融合。骨髓瘤细胞在
体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体，而抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了连个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。
25.骨髓瘤细胞发生回复突变每3-6个月应用8-氮杂鸟嘌呤（8-AG）筛选一次，以便杀死突变细胞
26.细胞融合的方法：常用的有转动法和离心法.
27.杂交瘤细胞的克隆化的方法有：有限稀释法和软琼脂平板法，显微操作法
28.双特异性抗体：是含有两个不同配体结合位点的抗体分子，它有两个不同的抗原结合部位（两个臂），可分别结合
两种不同的抗原表位。其中一个可与靶细胞表面抗原结合，另一个则可与效应物（如药物，效应细胞等）结合，从而将效应物直接导向靶组织细胞。
29.细胞内抗体：亦称内抗体，主要是指细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体。
30.如何构建噬菌体抗体库？构建噬菌体抗体库通常包括以下几个过程：1.从外周血或脾，淋巴结等组织中分离B细胞，
提取mRNA并反转录为cDNA2，应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的抗体基因片段3，构建噬菌体载体4，用表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多伦的抗原亲和吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异性地抗体克隆。筛选为关键环节和步骤。
31.疫苗的组成：具有免疫保护性的抗原（Ag）如蛋白质，多肽，多糖或核酸等与免疫佐剂混合制备而成。
32.佐剂是指能非特异性的增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，可先于抗原或与抗原一起注入机体。
33.目前用于人体的佐剂只有两种：1，铝佐剂（氢氧化铝或磷酸铝）2，MF59
34.灭活疫苗和活疫苗的特点比较：（P122,表5-4）
35.联合疫苗包括多联疫苗和多价疫苗，多联疫苗可用于预防由不同病原微生物引起的传染病，而多价疫苗仅预防同一
种病原微生物的不同亚型引起的传染病。
36.核酸疫苗是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起机体保护性
免疫反应的抗原的编码基因和载体组成。核酸疫苗又称为基因疫苗，基因免疫或核酸免疫
37.酶的分离纯化过程必须遵循以下原则：
1、全部操作一般在低温（0-4摄氏度）进行。
2、在分离提纯过程中，不能
剧烈搅拌。
3、在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA,少量 –巯基乙醇等
4、在分离提纯过程中要不断测定酶的的活力和蛋白质浓度，以对纯化过程进行检测。一般用两个指标来衡量分离纯化方法的好坏：总活力的回收率和比活力提高倍数。
38.传统的酶固定化方法大致可分为载体联合法，交联法和包埋法
39.固定化对酶稳定性的影响：
1、热稳定性提高
2、对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高
3、对PH，蛋白酶，储存
盒操作条件的稳定性提高
40.目前常用的菌种保藏方法有：
1、斜面低温保藏法，一般可保存1-6个月左右
2、石蜡油封存法 ，一般可保存1-2年左右
3、砂土管保藏法，保藏期约1-10年
4、麸皮保藏法 ，保藏期在一年以上
5、甘油悬液保藏法，-20度保藏期约为0.5-1年，-70度下保藏期可达10年
6、冷冻真空干燥保藏法，5-15年
7、液氮超低温度保藏法，15年以上
8、宿主保藏法
41、产物产量的测定方法有：生物测定法和化学测定法，一般采用化学测定法，以求迅速跻身反应生产情况。 中国微生物菌种保藏委员会CCCCM中国典型培养物保藏中心CCTCC
美国典型菌种保藏中心 ATCC美国的北部地区研究实验室NRRL
英国的国家典型菌种保藏所NCTC日本的大阪发酵研究所IFO
德国菌种保藏中心DSM
42、中间反应产量测定：产物产量、ph值、糖、氨基酸、菌丝形态。
43、PH对发酵的影响有哪些？
1.PH影响酶的活性，当PH值抑制菌体的某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻
2.PH影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢物的排泄，
因此影响新陈代谢的进行
3.PH影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用
4.PH影响代谢方向，PH不同，往往引起菌体代谢过程不同，是代谢产物的质量和比例发生改变。
44、基因工程菌发酵生产的特点？采用基因重组技术构建的基因工程菌与细胞，由于带有外来基因，对其进行培养和
发酵的工艺技术通常与单纯的微生物细胞的工艺技术有不同之处。基因工程菌发酵的目的主要是实现外源基因的高效表达，以获取大量的外源基因产物。而外源基因的高技术表达不仅涉及宿主、载体与外源基因三者之间的相互关系，与所处环境条件密切相关。基因工程菌发酵一般分两个阶段：前期是菌体生长阶段，后期是菌体生长阶段。
45、基因工程菌不稳定性的原因？主要表现在质粒的不稳定性以及表达产物的不稳定性。而质粒的不稳定性又分结构
的不稳定性以及分离不稳定。结构不稳定性是由于转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排与损失。分离的不稳定性是细胞分裂过程中发生的不平均分配，从而造成质粒的缺陷型分配，以致造成质粒丢失。引起质粒载体不稳定性的原因只要是宿主新陈代谢负荷的加重，大量外源蛋白的形成对宿主细胞的损害，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长的快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致了基因工程菌的不稳定性。
46、突变生物合成：采用一些诱变剂，如紫外线，激光，高速电子流或一些化学药物如亚硝基胍，溴化乙啶等对药物
的产生菌进行诱变，是他们丧失合成某种中间体的能力，因而不能合成原来结构的化合物，陈武阻断突变株。在发酵培养这些阻断突变株时添加某些天然或化学合成的化合物作为中间体，这些突变株能利用这些中间体合成一些新结构的最终化合物，这个过程称为突变生物合成。
47、微生物转化系酶促化学反应，具有与通常有机化学反应不一样的特点：
1.以具有活性中心和特殊空间结构的酶作为催化剂
2、对作用的基质有严格的选择性和专一性
3、酶催化反应的速度极高，非一般催化剂可比
4、一般在常温常压下进行，反应条件温和
48、微生物对甾体转化反应的特点：在微生物转化过程中，专一，有效的菌体量的多少，以及甾体底物在水相的溶解
性等问题成为影响转化率的重要因素，目前采用的两阶段发酵及两相发酵方法很好的解决了这些甾体微生物转化中的问题。
49、蛋白质药物对化学修饰的意义：
50、最常用的修饰剂有：主要是水溶性高分子聚合物，如葡聚糖、右旋糖苷、肝素以及低分子肝素、多聚唾液酸、聚
乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、PEG、白蛋白等。目前以PEG最常用的。其毒性小、无抗原性、溶解性良好。
51、修饰策略有随机修饰与定点修饰两类。氨基修饰主要用随机修饰，在利用特定的修饰剂可以实现定点修饰。巯基
修饰多为定点修饰。羧基修饰为定点修饰。
52、选择PEG修饰剂应该考虑的因素：PEG的Mr，修饰位点，水解稳定性和反应活性。
53、核酶：核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具有催化活性的核酸分子。目前已知的具有核酶催化功能的RNA结
构至少可以分成5类：发夹状核酶，锤头状核酶，I型内含子核酶，RNaseP核酶，丁型肝炎病毒核酶等
54、反义核酸：是指具有抑制基因表达作用。包括反义RNA、反义DNA分子，由部分RNA和部分DNA形成RNA-DNA
嵌合分子，以及经高度化学修饰的寡聚核酸类似物，这些分子统称反义核酸类药物。
55、褔米韦生经美国FDA批准上市成为第一个反义核酸类药物。
56、RNAi:即RNA干扰现象，是近几年发现的一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默过程。主要阶段：
启动阶段和执行阶段
57、小干扰RNA(siRNA)：在启动阶段，当细胞由于病毒感染等原因出现双链RNA分子或带有较长双链的发卡结构
RNA时，细胞中的Dicer的核酸酶会识别其双链RNA，将其降解成21~23bp长的小干扰RNA。主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。
