食品微生物教学实习报告
一、大肠菌群检验的准备工作
1、设备和材料
冰箱（2℃~5℃）、生化培养箱（37℃，24~48h）、手提式高压蒸汽锅、干燥箱（160 ℃，1~2h）、天平（感量0.1g）、无菌吸管（1ml、10ml或微量移液器及吸头）、无菌锥形瓶、无菌培养皿
2、培养基和试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）：称取7.12g溶解于100ml蒸馏水中，分装到有玻璃小倒管的6支试管，每管10ml；再将剩下的稀释一倍，分装到有玻璃小倒管的3支试管，每管10ml；121℃高压灭菌15min。
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）：称取4g溶解于100ml蒸馏水中，分装到有玻璃小倒管的9支试管，每管10ml；121℃高压灭菌15min。
伊红美兰营养琼脂：称取10g溶解于200ml蒸馏水中，装于无菌锥形瓶中，121℃高压灭菌15min。
葡萄糖发酵管：称取2.5g溶解于100ml蒸馏水中，分装到有玻璃小倒管的20支试管，每管5ml；121℃高压灭菌15min。
革兰氏染液：草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、沙黄水溶液
无菌生理盐水：称取4.5g溶解于500ml蒸馏水中，装到500ml的玻璃瓶中；121℃高压灭菌15min。
二、培养物的灭菌处理
1在夹层锅中加水没过电热管
2将待灭菌的培养基装入内筒，注意不要过紧，以免影响蒸汽的流通和灭菌效果。3将内筒放置在锅内的搁架上。将排气阀下面的蛇形管插入内筒内壁的半圆管中，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。
4将高压锅置于热源之上（电炉、煤火炉均可，如自带加热炉丝的，可直接接通电源）加热，待压力表指针达到0.05MPa时，打开排气阀，待指针回零，并且排净空气后，关闭排气阀，使压力上升，达到0.1MPa时，维持25~30min（根据需要控制温度时间，一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min），关闭热源，待指针回零后，打开排气阀排气（注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外），再将高压锅盖打开，利用锅内的余热烘干包装纸。灭菌后的培养基空白培养。
5灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。
6培养过细菌的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌15～30分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。
三、无菌操作
（一）操作前将界面上的细菌和病毒等微生物杀灭。
1、玻璃器皿的消毒和清洁
⑴新购玻璃器皿的处理新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%～2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。
⑵污染玻璃器皿的处理
①一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分钟，或在3%～5%漂白粉澄清液内4小时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗至无肥皂为止。最后用少量蒸馏水冲洗。
②细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌15～30分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。
③吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。
④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。
⑤染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。
⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。
2、无菌器材和液体的准备将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120℃的干燥箱中干燥灭菌2小时，取出备用。对于手术器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压蒸气灭菌法，即在15磅的条件下，加热20分钟。而对于MEM培养液、小牛血清和消化液等需用G5或G6滤器负压抽滤后使用。
（二）操作过程中是界面与外界隔离,避免微生物的侵入。
无菌操作过程在无菌操作过程中，最重要的是要保持工作区的无菌、清洁。因此，在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的止血钳、镊子等。培养瓶应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后1/3处，戴上胶皮乳头，并用酒精灯烧烤之后再吸液体。此外接种过程无菌操作应注意先用75%酒精擦手，手干后点燃酒精灯；接种过程不离开酒精灯火焰；接种环在接种前后要用火焰灼烧；所有使用器具经过严格灭菌并不准乱，尤其是棉塞等；接种用的培养基事先应做无菌培养试验（37℃24～48h）
四、生化培养箱和超净工作台的使用
生化培养箱的使用：
1、打开箱门，将待处理物件放入箱内搁板上，关上箱门。
2、接通电源，将三芯插头插入电源插座，将面板上的电源开关置于“开”的位置，此时仪表出现数字显示，表示设备进入工作状态。
3、通过操作控制面板上的温度控制器，设定您所须要的箱内温度
当设定温度大于环境温度5℃以上，请将制冷转换开关置于“RT+5℃”。（温度控制器详细操作说明见后页。）
4、仪器开始工作，箱内温度逐渐达到设定值，经过所需的处理时间后，处理工作完成。
5、关闭电源，待箱内温度接近环境温度后，打开箱门，取出物件
超净工作台使用：
1、使用前的检查
（1）接通超净工作台的电源；
（2）旋开风机开关，使风机开始正常运转，这时应检查高效过滤器出风面是否有风送出；
（3）检查照明及紫外设备能否正常运行，如不能正常运行则通知工程部检修；
（4）工作前必须对工作台周围环境及空气进行超净处理，认真进行清洁工作，并采用紫外线灭菌法进行灭菌处理；
（5）净化工作区内严禁存放不必要的物品，以保持洁净气流流动不受干扰。
2、使用
（1）使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒；
（2）接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，30分钟后，关闭紫外灯，开启送风机；
（3）工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰；
（4）操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒；
（5）最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源；
（6）每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况；
（7）每月进行一次维护检查，并填写维护记录。
3、清洁
（1）每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录；
（2）取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘；
（3）用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干；
（4）要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净，保持表面清洁，否则会影响杀菌能力；
（5）效果评价:设备内外表面应该光亮整洁，没有污迹。
