绪论
1, 细胞工程：是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水
平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。狭义的细胞工程是指细胞融合和细胞培养技术。
根据研究对象的不同，高等生物的细胞工程分为动物细胞工程和植物细胞工程。动物细胞工程包括细胞培养技术（包括组织培养、器官培养），细胞融合技术，胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等），克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆和个体克隆）。植物细胞工程包括植物组织、器官培养技术，细胞培养技术，原生质体融合与培养技术，亚细胞水平的操作技术等。
2, 植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操 作，使细胞得某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程称… 植物细胞工程的应用：
1， 利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。 2， 利用培养变异，筛选优良的突变体。 3， 倍性育种，缩短育种年限。
4, 离体种质保存。 5,
细胞培养生产有用的物质。 第二章
一， 实验室设置及内部设备
实验室建设应考虑的问题：
1、实验的性质
2、实验室的规模
细胞工程实验室: 基本实验室:准备室、无菌操作室、培养室 贮藏室 辅助实验室：细胞学实验室、生化分析实验室 温室
1、准备室
完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装及高压灭菌；器皿、材料的洗涤等工作。
主要设备
纯水器 工作台 药品厨 天平电磁炉 冰箱 玻璃器皿 酸度计 高压灭菌锅 干燥箱等
2、无菌操作室 （接种室）
用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。
接种室应用推拉门，设有缓冲间，面积2m2为宜。进入接种室前更衣换鞋，减少带入接种室杂菌。
接种室主要设备
超净工作台 ：每次实验前要用紫外灯灭菌20min，关掉紫外灯开始工作，工作过程中注意一直开着吹风机。
无菌操作用具： 离心机 细胞融合仪
3、培养室
用于接种材料的培养。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。 控制：温度、光照、湿度。
培养室主要设备：培养架 空调 时控器 自动开灯、关灯温度自动记录仪 摇床 二 ，培养基
1，培养基的种类
1 培养基根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。根据作用不同，培养基为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。 根据营养水平不同，培养基分为许多种,常用如下： （1） MS培养基：富盐平衡培养基（还有LS、BL、ER）
特点: ①无机盐浓度较高，元素比例合适，是较稳定的平衡溶液；②微量元素种类齐全； ③营养丰富 。
（2）B5培养基 ：高硝态氮培养基（还有N6和SH培养基）
特点: ①硝酸钾含量高； ②氨态氮含量低； ③ VB1含量较高。 （3）N6培养基：高硝态氮培养基
特点：硝态氮含量高，氨态氮含量较低。
（4）White培养基：低盐培养基（还有WS、HE、改良Nitsch等 特点：无机盐含量低，有机成分也很低，适于生根培养。 （5）KM-8P培养基：
特点:有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。 培养基成分：水 无机盐 有机成分 植物激素 培养物支持材料 辅助性物质 2，植物激素的应用规律
①先Aux后CKs处理,有利于细胞分裂但不利于细胞分化。容易产生多倍体细胞（核分裂和胞壁形成不同步所至）， cks有利于胞壁形成。
②先CKs 后Aux处理，细胞分裂也分化(可能是内源生长素起作用) ③ Aux 和CKs 同时处理，分化率提高。 Aux与CKs的比值改变形态建成的方向。
高 有利根分化，抑制芽形成； Aux / CKs 适中 促进愈伤组织生长；
低 有利芽分化，抑制根形成；
在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异, 培养基配制：
1、确定配方
2、移母液
3、定容
4、称蔗糖
5、调PH值（用0.1MNaOH或HCl调PH值为5.8）
6、培养基熬制（加琼脂）
7、分装（100ml的三角瓶约装入30－40ml, 30瓶/L）
8、扎口
9、灭菌
10、接种 三，植物材料灭菌
灭菌方法 ①.培养基灭菌：高压湿热灭菌，某些激素采用过滤灭菌
②.玻璃器皿灭菌：干热灭菌：150℃ 40min;120℃ 2h，湿热灭菌：121℃, 30min 接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
③.接种工具灭菌：用前干热灭菌，用前湿热灭菌，接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。 电热石英砂灭菌器 ④.实验服、口罩灭菌：湿热灭菌
⑤.接种室灭菌 ：紫外灯照射(接种室、超净台)：波长260nm，距离小于1.2m，15-20min。臭氧灭菌机：1-2h,熏蒸灭菌：(5-8ml甲醛+5g高锰酸钾)/ m3 ,接种台喷雾消毒：75%酒精。 ⑥.培养室灭菌 : 新建培养室用前要彻底熏蒸1次。
隔1周用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。
⑦.物体表面灭菌: 灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌 ,范围：超净台的台面和四壁、双手 消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；1%新洁尔灭等。
⑧.接种材料消毒: A, 取材 营养器官：根、茎尖、茎段、叶片等
生殖器官：胚胎（胚、胚珠、胚乳等）和花药 等
外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料 外植体灭菌
用化学灭菌剂灭菌
2 消毒步骤：①流水冲洗或洗衣粉漂洗②用化学灭菌剂浸润消毒通常：70%酒精30S，0.1%升汞4-10min。表面有较厚蜡质层的的可加吐温-20或吐温-80等浸润剂(灭菌液的0.5%)。 ③无菌水冲洗3-5次。注：灭菌液要浸没材料 第三章 植物细胞全能性与形态发生
一、植物细胞全能性(totipotency)：植物体每个正常细胞都含有该植物的全部遗传信息，在适宜的条件下如同受精卵一样, 具有发育成完整植株的潜在能力。
细胞分化〔cell differentiation〕指由于细胞分工而导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。 细胞脱分化〔cell dedifferentiation〕培养条件下使一个已分化的细胞失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生细胞状态或胚性细胞状态的过程。或具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程。
愈伤组织〔callus〕植物离体培养过程中脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生的无组织结构、无明显极性、松散的细胞团称为愈伤组织。多在外植体切面上产生。
愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。成功地脱分化将导致细胞分裂，形成愈伤组织或胚性细胞团。
植物胚胎干细胞：植物连续的器官分化是由顶端分生组织细胞发育而成，因此，植物顶端分生组织细胞具有较强的表达全能性的能力，被称为植物胚胎干细胞。
生理脱离效应;当细胞或组织脱离母体以后，在适宜的条件下将进行一些特殊的发育方式，如再生、复壮等，child将其称为生理脱离效应
（细胞）或（组织）与母体分离和激素的调控是细胞全能性表达的前提。 在离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的。脱分化是细胞全能性的表达前提，再分化是细胞全能性的表达最终体现。
静止细胞(G0细胞)启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。
细胞脱分化的三个阶段 ：1，启动阶段 细胞质增生并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白出现。 2，演变阶段 细胞核向中央移动，质体转变为原质体 3，脱分化终结期，回复到分生组织。
细胞再分化〔redifferentiatio〕脱分化后无序生长的分生细胞在离体培养下，重新恢复细胞分化能力，经过细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。
极性(polarity)：植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志（即细胞分化的标志）。 激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下，调控细胞脱分化和再分化的主要因素。其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。
在离体培养条件下TEs则由愈伤组织薄壁细胞分化形成这是愈伤组织细胞分化器官的前提。 植物的离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。
离体培养中器官发生的方式
通过器官发生形成再生植株大体上有3种方式：
①先芽后根:是应该选择的方式.②先根后芽 ③根芽同长 植物细胞经再分化形成植株有2条途径：（在离体培养条件下）器官发生 体细胞胚胎发生 体细胞胚（胚状体、体胚）：指离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。
胚状体有以下几方面的界定：
①体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；②体 3 细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；③体细胞胚经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。
经过愈伤组织的胚胎发生需要3个培养阶段： ①诱导外植体形成愈伤组织；②诱导愈伤组织胚性化 ，③体细胞胚形成。 体细胞胚的结构与发育特点
1、与器官发生途径相比，体细胞胚在组织学上有3个特征： ①体细胞胚最根本的特征是具有双极性，即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都是单极性的；
②体细胞胚的维管组织与外植体现存组织无解剖结构上的联系，而不定根或不定芽与外植体或愈伤组织的维管组织有联系。
③体细胞胚胎的维管组织分布是独立的Y字形结构，不定芽维管组织无此结构。 人工种子：（狭义）植物离体培养中产生的体细胞胚，包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。
（广义）在体细胞胚、微型营养变态器官、不定芽等微繁体之外加上必要的营养成分后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。 第四章 离体培养下的遗传与变异
离体培养中的遗传与变异特点：
1、普遍性：变异可发生在各种培养类型中； 变异发生在各种植物的培养中；变异发生与培养类型有关。
2、局限性：一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。
3、嵌合性：是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞它是组织培养中常见的现象。 体细胞变异诱导材料的选择：其一，目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生整株，则不能进行后续的各项操作。 其三，适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。 第五章植物主要的组织培养技术 第一节快繁
无性繁殖途径：
1、无融合生殖：即不经过减数分裂和受精而形成种子。
2、营养繁殖：即由母株的营养体部分再生出新的植株 植物离体快速无性繁殖：利用离体培养技术,用优良植株的外植体进行培养,在短期内获得大量遗传一致的个体的方法，这种离体无性繁殖方法由于繁殖速度快，又称离体快速无性繁殖。所获得的株群称单株无性系或单芽无性系
初代培养 ：芽、茎段、叶片等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程。即接种某种外植体后，最初的几代培养。
生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程 植物快繁常见问题及对策：
（一）污染的原因及预防：原因：细菌、真菌为病源菌；污染途径有外植体带菌，培养基及器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守操作规程，环境不清洁。 预防措施：（1）防止材料带菌：避免阴雨天在室外采集外植体；春秋组培；材料预培养。（2）严格外植体灭菌（3）接种用具灭菌彻底（4）严守无菌操作规程（5）保持培养室清洁
（二）褐变的原因及预防原因（1）植物品种（基因型）（2）生理状态（3）培养条件（4）材料转接季节 防止措施（1）选择适宜的外植体（2）连续转接3）先液体培养再固体培养（4）加抗氧化剂（5）选择合适的培养条件加活性炭或 暗处培养。
（三）玻璃化的原因及预防原因：
（1）激素浓度（尤其CTK）高（2）琼脂浓度低（3）光照弱（4）温度高（5）通风条件不好（6）培养基离子种类及比例不适宜 预防措施：（1）适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基的水势。（2）适当降低CTK的浓度。考虑加入适当的脱落酸。（3）增加自然光照；增加容器通气，控制温度。（4）加入活性炭、多效唑或CCC等物质。 第二节、植物脱毒快繁技术 1热处理脱毒原理：
①病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。
②热处理是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，能够获得无病毒植株。
2、热处理脱毒方法：(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好。将生长的盆栽植株移入温热治疗箱内（35-40℃）处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。
分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：
1、植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。
2、当植物细胞分裂DNA复制时，病毒DNA随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，正常核蛋白合成占优势，使病毒无法进行复制。
3、茎尖中存在高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。
4、在植物体内存在有一种“病毒钝化系统”，在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。
第三节 花药和花粉的培养
花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。（器官培养） 花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。（细胞培养）
单倍体：具有配子体染色体数的孢子体。
单倍体植物3个明显特点：
1、体细胞染色体数减半
2、生长发育弱，体形小
3、雌雄配子严重不育
花药、花粉培养的意义
1、迅速获得纯合型材料，提高选择效率，缩短育种年限
2、获得育种中间材料
3、突变体选育
4、体细胞融合
5、遗传研究
6、获得染色体异附加系和代换系
7、遗传工程受体 花粉植株再生途径：
1、经由成愈伤组织再生植株
2、经由胚状体再生植株 花粉分离收集：
由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。方法： 1）花粉漂浮自然释放法:将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放。 2）人工挤压法:用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。
5 3）机械法:用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。
释放的花粉粒→ 尼龙网（孔径20—60um）过滤，除去药壁等组织 → 500-1000转/分离心1-5分钟，收集花粉。
花药培养过程中花药为什么要经过低温处理 低温处理的作用机理：
1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。 2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。
3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。 花药培养时为什么要用较高浓度蔗糖和较低浓度激素？
蔗糖浓度 培养基中蔗糖浓度比其它组织培养高，尤其早期培养，一般5%—10%原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。
激素 花药壁分化程度高，重新分裂需要较高的激素浓度才能启动。因此，花药培养基的激素水平要相对较低才能抑制二倍体细胞的分裂。确定适宜的激素浓度，以促使花粉细胞分裂的同时又抑制花药二倍体细胞分裂是成功获得单倍体的关键。 第四节 胚胎培养
胚胎培养类型 胚培养 胚乳培养 子房培养 胚珠培养
胚培养概念：无菌条件下，把胚从种子、子房或胚珠中分离出来，在培养基上进一步生长发育形成幼苗的过程。
成熟胚培养：是指子叶已形成的种胚。仅提供一定的温度、湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育
成熟胚培养意义：克服发芽障碍；打破种子休眠，缩短育种周期等。 幼胚培养：胚龄处于原胚期、球形胚、心形期、早鱼雷期的培养。
幼胚培养意义：
1、克服远缘杂交不育
2、克服珠心胚干扰，提高育种效率
3、幼胚具有较高再生能力，可通过体细胞胚胎发生产生大量的再生植株。
4、为原生质体培养、细胞融合及基因转化提供试验材料。 幼胚培养时胚的发育方式有哪几种？各有何特点？
① 胚性发育：幼胚的离体培养，仍按在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株
② 早熟萌发：离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。
③愈伤组织：在许多情况下，幼胚的离体培养首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。 胚乳按发育初期是否形成细胞壁分为①核型胚乳②细胞型胚乳③沼生目型胚乳 试管受精：培养未受精的胚珠或子房并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有生活力的种子。 未授粉胚珠子房培养与授粉后胚珠子房培养有何不同？
根据培养的胚珠是否受精将胚珠培养分为受精胚珠的培养和未受精的胚珠的培养。(1)未受精的胚珠的培养,目的是为试管受精提供雌配子体。(2)受精后胚珠的培养,胚珠内胚的发育处于早期阶段,从两个细胞的原胚开始至球形胚阶段。
6 第六章 植物细胞培养及次生产物代谢生产
植物细胞培养：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其 增殖的技术.培养方法：培养规模:小规模培养 大批量培养
培养方式:悬浮培养平板培养 看护培养 产物不同:诱变培养 次生产物培养
培养方式：悬浮培养、单细胞培养、植物细胞的规模化培养及有用物质生产
悬浮培养（cell suspension culture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。
成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：
1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加1倍。
培养周期的概念 具有一定起始培养密度的单细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程，称为一个培养周期。
悬浮细胞培养的同步化：指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。（植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。）
细胞同步化的方法：①分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。
②饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
③抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 ④低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。
单细胞培养
1、平板培养
2、看护培养
3、微室培养
4、双层滤纸培养 植物次生代谢产物：植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。
植物细胞大规模培养的技术要求：从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件
1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。
2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。
3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。 固定化培养系统--固定化培养技术的优点在于：
1、可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；
2、细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；
3、由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；
4、正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。
7 利用细胞培养生产有用物质的一般程序
1、选材 应注意条件：①药效肯定②对其有效成分有充分的了解④市场短缺或价格昂贵；③有测定有效成分和药理的可靠方法⑤取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。
2、细胞株系建立
3、大量培养
4、产品提取与纯化 第七章 原生质体培养与融合 原生质体（Protoplast）：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
原生质体材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理)原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。 原生质体纯化方法有：
离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。
接口法 原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。 原生质体培养方法
1、固体包埋培养（原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37C左右）混合，培养于培养皿中。）
2、固体平板培养
优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。 缺点: 操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。
3、液体浅层培养(将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。) 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。
4、固、液培养 优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
缺点：不易观察细胞的发育过程。
5、共培养法（将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合）
6、琼脂糖珠培养
7、饲养层培养
原生质体再生：再生细胞壁、细胞分裂和生长、植株再生（愈伤组织形成）
原生质体融合又称体细胞杂交是指将植物不同种、属甚至科间的原生质体通过人工诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。 融合方法
1、NaNO3法 NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合 8 在一起 不足：诱导频率不高。
2、高pH-高Ca离子法 优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用
3、PEG法 特点：融合频率高、可重复性强、诱发融合无特异性、毒性较低
4、电融合法 特点 不存在对细胞毒害的问题、融合效率高、融合技术操作简便 原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。 供体-受体式细胞融合包括非对称杂交和细胞质杂交两种方式。
非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞质融合；
细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。 第九章后
1, 超低温通常是指-80℃以下的低温。常用的保存介质或容器有：超低温冰箱（-80～-150℃）、液氮（-196℃）和液氮蒸汽箱(-140℃液氮)等。
2, 用于离体超低温保存的植物材料一般有愈伤组织、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖等。 3, 细胞内外水的冻结状态时细胞冻存技术的关键。
4, 种质超低温保存的关键是降温冰冻过程中避免细胞内结冰。在降温过程中必须使细胞发生适当程度的保护性脱水，使细胞内外的水流到细胞外结冰，并且在化冻过程中防止细胞内次生结冰。因此针对不同种类的植物材料，筛选合适的冰冻保护剂，采用适当的降温冰冻速度和化冻方式可能使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度。
5, 超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活力和变异的评价及植株再生等几个步骤。
6, 降温方法从降温方式来看，有快速冰冻法、慢速冰冻法、两步冰冻法和逐级冰冻法等。 7, 玻璃化：是指液体转变为非晶体的固化过程。使溶液玻璃化得两条途径：大幅度提高冷却速率和增加溶液的浓度。
8, 玻璃化溶液（PVS1）,其中包含了20.5％的DMSO、15.5％的乙酰胺、10％的1,2-丙二醇以及6％的聚乙二醇，他们分别起到冰冻保护、毒性中和、强化玻璃化和非渗透聚合的作用。 9, 超低温保存方法主要有：玻璃化法、包埋玻璃化法、干燥法、预培养法、预培养-干燥法和包埋脱水法。
10, 包埋脱水法的三个步骤：先将材料用藻酸钙包埋，然后将包埋后含有保存材料的藻酸钙小珠在含有高浓度（或梯度浓度）蔗糖的培养基上预培养，最后侵入液氮。
11, 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。
12, 材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄及生理状态。 13, 冰冻保护剂具有的特点：易溶于水、对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。冰冻保护剂的作用主要表现在：增加膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻止低温伤害，降低冰点，提高容液的粘滞性，阻止冰晶生长。
