《文献检索》实习报告
幽门螺杆菌的左氧氟沙星耐药性及其基因分析
学
院：动物科学学院 班
级：******** 学
号：++++++++ 姓
名： **** 任课教师：李
光
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一、课题分析（确定检索词及分类号）（本题10分）
课题名称：幽门螺杆菌的左氧氟沙星耐药性及其基因分析
1、中文检索词： 幽门螺旋杆菌、左氧氟沙星、耐药性、基因分析 英文检索词：
Levofloxacin Resistance、Resistant Genes 、Helicobacter pylori
2、中图分类号：R573
二、制定检索式（检索式=检索词+布尔逻辑式）（本题10分）
检索式： 幽门螺旋杆菌*左氧氟沙星*耐药性*基因分析
三、选择检索工具：（本题共70分）
（二）、计算机检索（本小题50分）
1、使用馆藏目录查询系统，查找课题相关图书（要求3-5条）（5分）
例：编号 书名/作者.—出版社所在地：出版社，年
1孙啸 谢建明 周庆/R语言及Bioconductor在基因组分析中的应用.——科学出版社，2006 ○2胡润 陈宇华/财富基因==Fortune genes.——海南出版社，2003 ○3王身立/传承生命：遗传与基因。——上海科技教育出版社，2001 ○4吴晓波/大败局II：探寻著名企业“中国式失败”的基因.——浙江人民出版社，2007 ○5赵琳/大豆在暗诱导下光周期及衰老相关基因的差异表达研究.——中国农业科学技术出版社，2009 ○
2、根据所选课题，任选一种搜索引擎，在其中搜索课题中相关学术名词（要求不少于3条）（5分） 左氧氟沙星——具有广谱抗菌作用，抗菌作用强，对多数肠杆菌科细菌，如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门菌属、志贺菌属和流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、淋病奈瑟菌等革兰阴性菌有较强的抗菌活性。对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌等革兰阳性菌和肺炎支原体、肺炎衣原体也有抗菌作用，但对厌氧菌和肠球菌的作用较差。
耐药性（Resistanceto Drug ）——又称抗药性，系指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于化疗药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。目前认为后一种方式是产生耐药菌的主要原因。为了保持抗生素的有效性，应重视其合理使用。
基因突变——基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的可遗传的变异。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种隐定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。于是后代的表现中也就突然地出现祖先从未有的新性状。
3、选择中文数据库检出其与课题相关文献：（本小题40分）
(1)、使用《中国知网》数据平台进行高级或专业检索（要求各库检索结果不少于10条）（20分） a 中国期刊全文数据库 检索途径：主题
检索式：主题＝幽门螺旋杆菌*耐药性 检索结果：
[1]田一玲,蒋任举,李华平,杨致邦,.幽门螺杆菌VacA基因型与耐药性分析[J].重庆医学,2010,(13).
[2]于凌琪,.幽门螺旋杆菌的研究进展[J].中国慢性病预防与控制,2010,(2).
[3]张建中,.幽门螺杆菌感染疾病控制中的辩证思维[J].医学与哲学(临床决策论坛版),2009,(9).
[4]胡林,刘苓,.幽门螺杆菌耐药性的研究进展[J].贵州医药,2009,(10).
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[5]刘元德,卞荣兵,叶明好,.幽门螺杆菌耐药机制的研究进展[J].临床军医杂志,2009,(2).
[6]胡伏莲,.中国幽门螺杆菌耐药研究现状[J].胃肠病学和肝病学杂志,2008,(7).
[7]田拥军,张正茂,刘慎沛,叶嗣颖,.幽门螺杆菌对6种抗生素的耐药性及其机制的研究[J].中国现代医学杂志,2008,(7).
[8]胡伏莲,.幽门螺杆菌感染治疗新进展[J].医学与哲学(临床决策论坛版),2007,(6).
[9]虎月燕,陆斌,李树安,周曾芬,蒋海燕,张磊,李晓燕,段丽萍,陈娅蓉.幽门螺杆菌不同基因型和基因亚型与甲硝唑耐药性的研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2004,(3).
[10]张学英,焦健,李岩,王江滨.48例消化性溃疡患者幽门螺杆菌的耐药性调查[J].微生物学杂志,2003,(2).
b 中国博士学位论文全文数据库 检索途径：主题
检索式：主题=幽门螺旋杆菌 检索结果：
[1]赵大鹏.幽门螺杆菌感染以及高盐和多酚的刺激对增殖相关蛋白CIP2A表达的影响[D].山东大学: ,2010.
[2]石云.Th17细胞及IL-17在幽门螺杆菌感染中的功能研究[D].第三军医大学: ,2009.
[3]肖斌.幽门螺杆菌非编码小RNA的筛选、鉴定及miRNAs在幽门螺杆菌感染中负向调控炎症反应的作用研究[D].第三军医大学: ,2009.
[4]李晶.幽门螺杆菌动物模型菌株SS1定植因素分析[D].中国疾病预防控制中心: ,2009.
[5]曲伟.幽门螺杆菌在NO压力下的巯基亚硝基化修饰及蛋白质组反应特征[D].山东大学: ,2009.
[6]邵春红.幽门螺杆菌响应环境胁迫的蛋白质组学研究[D].山东大学: ,2008.
[7]孙各琴.幽门螺杆菌可塑区JHP947基因功能的初步研究[D].福建医科大学: ,2008.
[8]龙敏.幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的致病与免疫机理探讨[D].第一军医大学: ,2007.
[9]周刚.筛选鉴定双重耐药幽门螺杆菌和HBD-2融合蛋白的体外抗菌作用[D].浙江大学: ,2007.
[10]刘祥.乳酸杆菌膜表达幽门螺杆菌黏附素HpaA的活菌载体疫苗株的构建及保护效果研究[D].四川大学: ,2006.
c 中国优秀硕士学位论文全文数据库 检索途径：主题
检索式： 主题=幽门螺旋杆菌*耐药性 检索结果：
[1]于晗.幽门螺杆菌甲硝唑耐药的比较蛋白质组学初步研究[D].山东大学: ,2009.
[2]董天堂.杂合抗菌肽CL23和LH28的分子设计与表达[D].中国农业科学院: ,2008.
[3]胡平.幽门螺杆菌基因hp0410的克隆表达及HP0410的免疫原性研究[D].南方医科大学: ,2007.
[4]罗军.幽门螺杆菌napA基因的克隆、表达及NAP蛋白抗原表位研究[D].第一军医大学: ,2007.
[5]姚雪华.幽门螺杆菌CagA真核绿色荧光蛋白表达载体的构建[D].郑州大学: ,2007.
[6]赵玉霞.幽门螺杆菌融合蛋白UreB-Omp11在大肠杆菌中的表达与鉴定[D].郑州大学: ,2006.
[7]丁力.幽门螺杆菌CagA基因克隆及表达[D].郑州大学: ,2005.
[8]王宁.表达幽门螺杆菌鞭毛粘附素的重组大肠杆菌ghost型疫苗的制备及鉴定[D].第三军医大学: ,2005.
[9]黄德强.幽门螺杆菌耐药基因的DNA序列分析[D].江西医学院: ,2005.
[10]周林福.Hp全长CagA基因和霍乱毒素B亚单位基因的克隆与表达[D].浙江大学: ,2001.
[11]刘开云.幽门螺杆菌治疗性疫苗的动物实验研究[D].第三军医大学: ,2004.d 中国重要会议论文全文数据库 检索途径：关键词
检索式： 关键词=幽门螺旋杆菌 检索结果：
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[1]陈珍,程畅,朱诚.幽门螺旋杆菌相关蛋白基因CagA、UreB与CTB融合基因在番茄中的遗传转化[A]..2007中国植物生理学会全国学术会议论文摘要汇编[C].2007中国植物生理学会全国学术会议论文摘要汇编:,.
[2]项荷爱,叶丽英.自动消洗机应用体会[A]..2006华东地区消化病学学术大会论文汇编（浙江省分册）[C].2006华东地区消化病学学术大会论文汇编（浙江省分册）:,.
[3]项荷爱,叶丽英.自动消洗机应用体会[A]..第八届国际治疗内镜和消化疾病学术会议论文汇编[C].第八届国际治疗内镜和消化疾病学术会议论文汇编:,.
[4]李柏翰,吴家乐,王博平,黄建宏,方觉非.一个蛋白质与蛋白质作用网的拓朴研究(英文)[A]..全国复杂系统研究论坛论文集
（二）[C].全国复杂系统研究论坛论文集
（二）:,.
[5]尤新.罐头工业和食品添加剂[A]..青岛·2004年中国罐头工业协会年会、第二届罐头加工与包装技术、设备、产品展览会论文集[C].青岛·2004年中国罐头工业协会年会、第二届罐头加工与包装技术、设备、产品展览会论文集:,.
(2)、使用《万方数据库》检出其与课题相关文献：(要求检索结果不少于10条)（10分） 检索途径：关键词
检索式：左氧氟沙星
检索结果：
[1]童裳伦,张晓翔.氧氟沙星和左氧氟沙星与DNA的相互作用研究[J].光谱学与光谱分析,2010,30(2)
[2]陈泽忠,冯锋,杨文娟等.左氧氟沙星与牛血清白蛋白相互作用的液滴荧光法研究[J].光谱学与光谱分析,2008,28(7) [3]邹健,董洁,于晓峰.左氧氟沙星三联方案与常规四联补救方案治疗幽门螺杆菌感染的荟萃分析[J].世界华人消化杂志,2009,17(11) [4]陈华燕,刘日光.利福平联合左氧氟沙星在治疗骨科内植物迟发性感染中的应用[J].中国矫形外科杂志,2009,17(11) [5]王桂花.左氧氟沙星和帕珠沙星治疗呼吸道细菌感染的药物经济学分析[J].山东医药,2009,49(13) [6]李炳华,薛金梅,宋建民.左氧氟沙星与头孢呋辛联合阿奇霉素治疗社区获得性肺炎疗效对比[J].中国全科医学,2009,12(16) [7]曹渊,袁庆华,夏之宁等.荧光光谱法研究左氧氟沙星与MCM-41的相互作用[J].光谱学与光谱分析,2009,29(9) [8]曹国英,张菁,郁继诚等.左氧氟沙星片剂绝对生物利用度研究[J].中国抗生素杂志,2010,35(1) [9]弓巧娟,晋卫军,董川.左氧氟沙星的体内构型转化与同步一阶导数荧光光谱测定的研究*[J].光谱学与光谱分析,2001,21(5 [10]刘二保,卫洪清,韩素琴.化学发光法测定左氧氟沙星[J].光谱学与光谱分析,2004,24(4) (3)、使用《维普资讯—中文科技期刊数据库》检索与课题相关文献：(要求检索结果不少于10条)（10分） 选择传统检索
检索途径：题名或关键词
检索式：题名或关键词=左氧氟沙星*耐药性
检索结果：
1.韩永霞.结核病复发左氧氟沙星有效[J]医疗保健杂志，2009(12):35-35.2.刘金全.左氧氟沙星治疗小儿耐药性细菌性痢疾临床观察[J].赣南医学院学报。2009,29(4):619-619.3.岳云端.左氧氟沙星治疗下呼吸道感染临床分析[J].中国医疗前沿，2009(10):37-38.4.宋治安 杨庆梅.左氧氟沙星临床应用及不良反应分析[J].齐鲁药事,2009,28(1):34-35.5.刘春霞 余小霞 邱凯锋 李红玉 黄际薇.喹诺酮类抗菌药耐药性分析 [J].南方医科大学学报，2008，28(10)：1909-1910 6.熊峰左氧氟沙星三联疗法根除Hp临床观察.[J].中华腹部疾病杂志 , 2006, 6 (8)：588-589
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7.叶丽娟（编写） 母连军（校）.抗菌药物对呼吸道病原菌敏感性的比较[J].国外医药：抗生素分册，2005,26(6)：268-270.8.陈军.左氧氟沙星治疗的几点新见解[J].国外医药：抗生素分册，2005，26(3)：121-123.9.仲宇慧 王莉.左氧氟沙星的不良反应[J].黑龙江医药，2010，23(2)：270-271.10.曲光 母连军.左氧氟沙星对严重感染的临床应用[J].国外医药：抗生素分册，2005，26(3)：124-126.
四、课程论文：根据所选课题，下载或写一篇课程论文。（*要求下载的论文必须和所拟定的课题紧密相关并且为学术论文的规范格式）（本大题10分）
幽门螺杆菌的左氧氟沙星耐药性及其基因分析
寿佩勤，费红军，岑叶平，王布江，陈新江
(1.宁波天一职业技术学院医学技术系,浙江宁波315104;2.宁波市第一医院,浙江宁波315010) 摘要:分析了宁波地区幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)对左氧氟沙星的耐药情况，探讨了Hp对左氧氟沙星的耐药机制.取患者胃钻膜组织分离培养Hp，检测Hp对左氧氟沙星的耐药率;提取左氧氟沙星耐药HpDNA, PCR扩增并测序比较.结果表明:宁波地区Hp对左氧氟沙星的耐药率为22.5%，左氧氟沙星耐药Hp菌株gyrA基因91位密码子发生点突变.提示宁波地区Hp对左氧氟沙星已产生一定的耐药性;左氧氟沙星耐药Hp gyrA基因突变可能是本地区左氧氟沙星耐药的重要原因之一 关键词:幽门螺杆菌;左氧氟沙星;耐药性;基因突变 中图分类号:R573
随着常用根除幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)抗生素耐药性的逐年提高，将左氧氟沙星列入三联/四联疗法已是目前应用较多的根除Hp的手段，有关其临床使用效果也有不少报道.但Hp对咬诺酮类药物较易获得耐药，并且该类药物存在着交义耐药性.已有报道表明[1-2],Hp对左氧氟沙星的耐药率为1.4%一 21.5%.在目前治疗Hp感染中应用左氧氟沙星较多的情况下，有必要对Hp左氧氟沙星耐药性进行检测，以便及时调整治疗方案，提高治疗效果.笔者检测了宁波地区Hp对左氧氟沙星的耐药情况，并对其耐药基因进行了分析。
1材料与方法
1.1材料
Hp菌株取自在宁波市第一医院接受胃镜检查的患者;HpNCTC11637标准株由浙江大学医学院病原生物学教研室惠赠.酪蛋白绵羊血平皿(宁波华美伦祥和医疗用品有限公司);UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司); PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司);药敏试验纸片(杭州微生物试剂有限公司);引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，T-A克隆试剂盒及插入片段测序(上海生工生物工程技术服务有限公司).1.2方法
1.2.1脚的培养和检测
取尿素酶快速鉴定阳性的168个患者胃钻膜活检组织标本作Hp培养和鉴定.将标本研磨后涂布在选择。性培养基上，37C微需氧环境培养5 d;将所得细菌进行革兰染色镜检，尿素酶及过氧化氢试验鉴定，分离获得脚40株，其中26株来自慢性胃炎患者，14株来自消化性溃疡患者.1.2.2药物敏感试验
采用抗生素药敏试验纸片琼脂扩散法，对分
离到的Hp进行左氧氟沙星药物敏感试验，同时进行阿莫西林、阿奇霉素、克拉霉素、甲硝唑的耐药情况对照.按照中国药品生物制品检定所制定的抗菌药物药敏试验判定标准判定结果.1.2.3Hp的DNA提取和PCR扩增
选取对左氧氟沙星耐药Hp菌株，按UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒操作说明提取Hp DNA，按照引物上游为5\'-TTTAGCTTATCATAT-3\'、引物下游为
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5\'-TCCAAGCGCATGGAAAATTCCATTCTCACTAGTGAA-3’扩增gyrA基因.PC R反应体系同文献[3].1.2.4 gyrA基因测序和序列分析
PCR产物的纯化及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，所得序列采用DNAman软件进行比对分析.耐药菌株gyrA的核普酸和氨基酸序列与敏感株和NCTC11637的gyrA基因序列作比较.2 结果
2.1药敏试验结果
40株Hp中9株对左氧氟沙星耐药，耐药率为22.5%，此结果已作报道[3].5株对阿奇霉素耐药的菌株同时对左氧氟沙星耐药;2株对灭滴灵耐药的菌株同时对左氧氟沙星耐药.2.2 PCR扩增结果
9株耐药Hp中有6株gyrA基因扩增出约240bp的PCR产物，部分结果见图1.2.3Hp对左氧氟沙星的耐药性与gyrA基因突变关系分析
与NCTC11637菌株和敏感菌株gyrA基因序列比较，左氧氟沙星耐药Hp第91位氨基酸Asp被Gly取代(91位密码子GAT中A→G).对左氧氟沙星敏感Hp中随机挑选6个进行检测，均未发现与左氧氟沙星耐药有关的91位密码子点突变.
3讨论
近几年来，人群中Hp耐药菌株比例不断上升，而且Hp耐药率在不同国家和地区不尽相同，对根除Hp感染带来了困难.左氧氟沙星是一种新型的氟喹诺酮类抗生素，对大多数革兰阳性菌和革兰阴性菌具有杀菌活性.国内外许多研究已表明，含有左氧氟沙星的新三联疗法在Hp根治方而有明显的疗效[4-5].但是随着左氧氟沙星在治疗Hp中应用的增多，Hp对左氧氟沙星的耐药性也逐渐产生.研究结果显示，宁波地区Hp对左氧氟沙星的耐药率已达到22.5%，分析认为这可能与临床其他抗感染治疗中左氧氟沙星应用的日益广泛，以及Hp治疗方案中左氧氟沙星使用率的逐渐提高有关，也有可能是以往较多使用咬诺酮类药物引起交义耐药所致. 左氧氟沙星对Hp的耐药机制主要发生在gyrA基因突变上，而gyrA耐药基因突变范围主要集中在67~106位氨基酸的区域.在本研究中，左氧氟沙星耐药Hp第91位氨基酸Asp被G 1y取代(91位密码子GAT中A-G)，而对左氧氟沙星敏感Hp菌株均未发现与左氧氟沙星耐药有关的91位密码子点突变.上述结果显示 gyrA基因中91位Asp突变可能是造成本地区Hp对左氧氟沙星产生耐药性的重要机制. 左氧氟沙星的抗菌作用机制是通过抑制细菌的DNA促旋酶活性，阻断细菌DNA合成和复制，产生快速杀菌作用.DNA促旋酶是1个由2个亚基即gyrA和gyrB组成的四聚体酶，分别由gyrA基因和gyrB基因编码，功能是将DNA分子由负超螺旋转为共价闭合双链分子.左氧氟沙星耐药Hp由于gyrA基因发生点突变造成gyrA空间构象改变，使左氧氟沙星不能结合gyrA基因，从而阻断了抑制Hp基因组复制的作用而导致细菌耐药.
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综上所述，宁波地区患者感染的Hp对左氧氟沙星已经产生了一定的耐药性，部分耐药Hp存在gyrA基因突变.因此，在使用左氧氟沙星三联疗法根治Hp时，如果出现疗效不显著应考虑出现耐药菌株的可能性.并且，Hp中gyrA基因突变可能是本地区Hp对左氧氟沙星耐药的主要因素.【参考文献】
[1] Lee C C, Lee V W, Chan F K, et al.Levofloxacin resistant Helicobacter pylori in Hong Kong[J].Chemo-therapy, 2008, 54(1):50-53.[2] Marzio L, Coraggio D, Capodicasa S, et al.Role of thepreliminary susceptibility testing for initial and after failed therapy of Helicobacter pylori infection withlevofloxacin, amoxicillin, and esomeprazole[J].Helico-batter, 2006, 11(4):237-242.[3]寿佩勤.费红军.岑叶平.等，宁波地区幽门螺杆菌优势基因型及其与耐药性的关系[[J]，现代实用医学.2010.22(2):148-151， [4]冷爱民.寻f;},张桂英，含左氧氟沙星四联幽门螺杆菌补救治疗方案的疗效观察团，临床药物治疗杂,\';, 2009,7(4):22-24.[5]高秀芳，以高剂量左氧氟沙星为基础的补救方案对幽门螺杆菌根除失败后的研究[[J]，中国医药论坛.2007.5(4):67-68.
