病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范
一、病理科免疫组织化学技术员培训规范：
凡新入我科的病理技术员均需进行免疫组化理论知识的学习、培训，经考核合格、具备病理技术员技士资质后方能从事免疫组织化学染色。
二、病理科免疫组织化学染色操作规范 1.免疫组织化学染色前的准备事项 (一)组织切片的制备
常规切片脱蜡至水（组织固定需用10%中性甲醛） (二)抗体的选择、稀释和保存
（1）选择抗体应先了解其反应谱和适用条件〔包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、稀释度和温育时间等〕。
（2）对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验;根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度
（3）抗体的原液应于分装后置于一20℃冷室中保存，切勿反复冻存(以免效价 降低)。 （4）抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。 （5）抗体的稀释。
(1)一般用0.01M PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，pH值7.2。 (2)或用0.05M TBS(生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液)，pH值7.6。 (3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。 (三)被检测组织内抗原的修复
（1）经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前，对于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。 （2）抗原修复缓冲液。
(l)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，用2M NaOH调节pH值至6.0)。 (2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高PH值的EDTA(50mM Tris.，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高pH修复液等。 （3）抗原修复的常用方法。 (l)胰蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化。
②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。
③37℃下温育20-40min(温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。
④蒸馏水冲洗，终止反应。
⑤阻断内源性过氧化物酶。
⑥进行免疫组织化学染色。（配制0.1%胰蛋白酶液时，应将0.1g胰蛋白酶溶于0.1%无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。）
（2)胃蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化. ②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。
③37℃下温育10-30min(一般为10min，可延至30min，取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短). ④浸人蒸馏水，终止反应。
⑤进行免疫组织化学染色。用1%胰蛋白酶液37℃下处理20min。(应以 0.1M HCI配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片 脱落。) （3)微波修复抗原法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。
②将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修复液 200ml，盖上具有小孔的盖子。
③将该容器置于微波炉(705-800W)中央加热(95℃)5min，2次(于两次之间，应向容器中添加蒸馏水50ml，严防组织切片干燥)。
④将该容器移出微波炉，置于室温下冷却15-20min。
⑤蒸馏水冲洗。
⑥阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。
⑦用TBS或 PBS液冲洗。 ⑧进行免疫组织化学染色。 (4)热水浴法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。
②向装组织切片的容器加人足量(例如200ml)抗原缓冲液，置于水浴锅中，加热至95 -99℃(不沸腾)预热。
③将组织切片插人已预热的容器内，温育20-40min。
④将该容器由微波炉移出，置于室温下冷却20min。 ⑤室温下，用TBS、PBS或水洗。
⑥蒸馏水冲洗。
⑦阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。
⑧用TBS或PBS液冲洗。
⑨进行免疫组织化学染色。
（5)压力锅法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。
②向4-5.5L的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液(约为锅容积的2/3)， 不加阀情况 下加热至沸腾。
③将组织切片插放于金属切片架上，并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。
④加阀情况下，将组织切片加压2min。
⑤压力锅自行冷却或以流水冷却减压后，持续20min。
⑥将冷却后的切片取出，蒸馏水冲洗后，置于TBS或PBS液中(以免组织切片干燥)。
⑦蒸馏水冲洗。
⑧阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。
⑨用TBS或PBS液冲洗。
⑩进行免疫组织化学染色。
（四）组织切片中内源性酶的阻断
1.内源性过氧化物酶 主要存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞了嗜酸性粒细胞和组织内。阻断方法:最常用0.3%-0.5%H2O2-甲醇液，作用15-30min， 阻断液必须使用时新鲜配制。由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性(使特异性着色减弱)，而大部分组织不含有内源性过氧化物酶，所以阻断内源性过氧化物酶一般不必作为常规步骤。必须阻断内源性过氧化物酶时，可安排在第一抗体反应后进行，以减少抗原的破坏。 2.内源性碱性磷酸酶 主要存在于嗜中性粒细胞和内皮细胞。阻断方法:应用1M左旋咪唑，作用15-30min。
3.内源性生物素 肝、胰、肾等的细胞内含有多量生物素或类生物素物质。 阻断方法:先将切片浸于卵白素(0.5μg/ml)中15min，以缓冲液洗净后，移浸于生物素饱和溶液中15min，再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液;也可应用商供的阻断试剂盒(按说明书操作)。 (五)正常血清保护
作为检测试剂的抗体蛋白带有一定的负电荷，免疫组织化学染色时，易与带有正电荷的组织〔特别是纤维组织、变性和(或)坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等〕发生静电吸引而导致非特异性染色。去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加第一抗体前，先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或是滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为1：5-1：20;必要时可滴加2%-5%牛 血清清蛋白。正常血清保护作用时间10-20min。用于阻断非特异性结合的血清不能有明显的溶血。 (六)缓冲液
用于稀释抗体，洗涤切片的缓冲液主要有两种。 1.TBS(0.05M，pH7.6)，
Tris一HCl缓冲液(0 .SM，pH 7.6) 100ml 8 .5%NaCl 100ml 蒸馏水加至 1000ml Tris一HCI缓冲液(0 .5M，pH7.6) 三经甲基氨基甲烷(Tris) 61g HCl 37ml 蒸馏水加至 1000ml 2．PBS(0 .IM，pH 7.6) Na2 HPO4 · 12H2O2 29g NaH2PO4 · 2H2O 3g NaCl 85g 蒸馏水加至 1000ml 使用时用蒸馏水稀释10倍即成0.0lM。
二、免疫组织化学染色常用方法 (一)直接法 1.脱蜡和水化。
2.3%过氧化氢或0.5%过氧化氢甲醇液，5min。
3.TBS或PBS缓冲液洗涤。 4.抗原修复。
5.无关动物正常血清(适当稀释)20-30min。
6.甩去正常动物血清，滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体，或增强的酶标多聚物一步法(Enhanced Polymer One-step Staining，EPOS)抗体于切片上， 20-60min。 7.TBS或PBS缓冲液洗涤。
8.0.04%-0.05%DAB(二氨基联苯胺四盐酸)H2O2液显色5-10min，镜下观察控制显色时间。底物配法:DAB 40-50mg；0.05M TBS(pH 7.6) l00ml；3% H2O2 100-200ml。 9.缓冲液洗，流水洗涤。 10.苏木精淡染细胞核。 11.脱水，透明，封片。 (二)间接法
l-5步同“直接法”。
6.滴加第一抗体于切片上，湿盒内温育30-60min。 7.TBS或PBS缓冲液洗涤。
8.HRP标记抗体或用增强的酶标记多聚物(Enhanced Labeled一 Polymer Sys- tem，ELPS)抗体滴加切片上，湿盒内温育30min。 9-14步同“直接法”的7-11步。 (三)过氧化物酶一抗过氧化物酶(PAP)法 1-5步同直接法。
6.适当稀释的第一抗体，湿盒内温育30-60min。 7.缓冲液洗涤。
8.第二抗体，湿盒内温育30min。 9.缓冲液洗涤。
10.滴加PAP，湿盒内温育30min。 11-15步同“直接法”的7-11步。
双PAP法:上述操作进行到第10步后，再重复7-10步1次，然后继续11-15步。 (四)葡萄球菌A蛋白(SPA)免疫酶法 1-5步同“直接法”。
6.第一抗体，湿盒温育30-60min。 7.缓冲液洗涤。
8.酶联SPA，湿盒温育30min。 9.缓冲液洗涤。
10-13步同“直接法”的8-11步。 (五)ABC法和SABC法
ABC法是卵白素-生物素-酶复合物(Avidin--Biotin--Peroxidase Complex)法的简称。SABC法是链霉卵白素-生物素-酶复合物(Streptavidin一Biotin一peroxidase Complex)法的简称。
l-5步同“直接法”。
6.第一抗体，湿盒温育30-60min.7.缓冲液洗涤。
8.生物素化的第二抗体，30min。 9.缓冲液洗涤。
10.ABC复合物或SABC复合物(皆于使用前新鲜配制)，30-60min。 11-15步同“直接法”7-11步。 (六)LSAB(SP)法
LSAB(SP)法，是标记的链酶卵白素-生物素(Labeled Streptavidin--Biotin)法的简称，操作步骤同“ABC法”，只是以LSAB复合物替代ABC复合物。 (七)CSA法
CSA法是催化信号放大(Catalyzed Signal Amplifieation)法的简称。 1-5步同“直接法”。 6.第一抗体，15-30min。 7.缓冲液洗涤。
8.生物素标记的第二抗体，15-30min。 9.缓冲液洗涤。
10.链霉卵白素-生物素-HRP复合物(用前新鲜配制)，15min。 11.缓冲液洗涤。 12.放大液，15min。 13.缓冲液洗涤。
14.HRP-StrePtavidin， 15min。 15-19步同“直接法”的7-11步。 (八)二步法Envision System Envision是通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体。 1-5步同“直接法”。 6.第一抗体，30-60min。 7.缓冲液洗涤。
8 .Envision TM，10-30min。 9-13步同“直接法”的7-11步。 (九)双重免疫组织化学法
1 .Sequential (1)鼠或兔抗体1，30-60min。
(2)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/HRP，30 min。 (3)DAB(棕色)，2-10 min。 (4)鼠或兔抗体2，30-60 min。
(5)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/AP，30 min。 (6)AP(红色)。 2 .Simnl一Aaneous (1)混合鼠抗体1和兔抗体2，4℃，过夜或60 min。 (2)Envision TM羊抗鼠/HRP和羊抗兔/AP。 (3)AP染色。 (4)HRP染色。
上述方法除注明温度者外，均可在室温(20-25℃)环境中进行;第一抗体温育后，如有必要可置于4℃ 下过夜。
三、免疫组织化学染色的常用抗体标记物 (一)上皮源性标记物 1.一般性标记物
（1）CK(角蛋白) CK亚型:①CK5/6;②CK7;③CK8;④CK10/13;⑤CK18;⑥CK19;⑦CK20。 (2)EMA(上皮细胞膜抗原)。
2.特异性和(或)相对特异性上皮标记物
（1）CEA(癌胚抗原，标记胃癌、大肠癌). （2）CA242(肿瘤相关粘液抗原，标记胰腺癌、大肠癌)。
（3）TG(甲状腺球蛋白，标记甲状腺癌). （4）PSA(前列腺特异性抗原，标记前列腺癌)。
（5）PSAP(前列腺特异性酸性磷酸酶，标记前列腺癌). （6）34βE12(标记前列腺底细胞). （7）AFP(甲胎蛋白，标记肝癌、内胚窦癌). （8）Hepatoeyte(标记肝细胞癌)。
(9)β-HCG(β-绒毛膜促性腺激素，标记胎盘滋养层细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤). （10）CA125(卵巢癌). （二)间叶源性标记物
主要是Vimentin(vim，波形蛋白)等.
（三）肌源性标记物 1.Desmin(Des，结蛋白) 2.Actin(肌动蛋白）. 3.SMA(平滑肌肌动蛋白). 4.MSA(肌特异性肌动蛋白).5.Myosin(肌球蛋白).6.Myoglobin(MG，肌红蛋白) 7.Myogen(肌浆蛋白).8.MyoDI(肌调节蛋白). (四)血管源性标记物 FⅧRAg(第8因子相关抗原).CD31 CD34 UEA-l BNH9.(五)组织细胞源性标记物 1 .CD68/KP-l.2.Lysozyme(溶菌酶)。 3.a1-AT(a1-抗胰蛋白酶).4.a1-ACT(al-抗胰糜蛋白酶) 5.Mac387.淋巴造血组织源性标记物 1.全淋巴细胞
(1)CD45/LCA(白细胞共同抗原）。 (2)TdT(末端脱氧核昔酸转移酶)。 (3)CD30/Ki-1。 2.全B细胞 (1)Igκ。 (2)Igλ。 (3)CD20/L26。 (4)CD79a。
(5)BLA36(B淋巴细胞抗原)。 3.B细胞亚型 (1)CDl0。
(2)CD21(标记滤泡性树突状细胞)。 (3)CD23。
(4)CD35(标记滤泡性树突状细胞)。 (5)CD38.4.全T细胞 (1)CD3。 (2)CD5。 (3)CD43。 (4)CD45RO/UCHL-1. 5.T细胞亚型 (1)CDla。 (2)CD4。 (3)CD8。 6.NK细胞 (1)CD56。 (2)CD57/Leu-7。 (3)CD16/Leu-11。 7.粒细胞和单核巨噬细胞 (1)CD11c/LeuM5。 (2)CD15/LeuM5。 (3)Lysozyme(溶菌酶)。 (4)al-AT(al-抗胰蛋白酶)。 (5)al-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)。 (6)CD68.(7)S-100蛋白.(8)Mac387。 8.其他
(1)EMA(上皮细胞膜抗原).(2)CD99(尤因肉瘤标记物).(3)ALK-l(间变性淋巴瘤激酶)。 (4)HLA-DR。 (5)Bel-2。 (6)Bel-6。 (7)Bel-10。 (8)Ki-67。
(9)CyclinD1(周期素D1)。 (10)CD25。
(11)CD34。
（七）神经源性标记物 1.S-100蛋白. 2.NSE（神经原特异性烯醇化酶）. 3.Leu7。
4.Neurofilament(NF，神经微丝蛋白)。 5.GFAP(胶质纤维酸性蛋白）
（八）神经内分泌源性标记物 1.激素标记物 (1)CA(儿茶酚胺)。 (2)5-HT(5-经色胺). (3)垂体激素。
①GH(促生长素)。
②PRL(催乳素)。
③ACTH(促肾上腺皮质激素). ④TSH(促甲状腺素). ⑤FSH(促滤泡素). ⑥LH(促黄体素)。 (4)甲状腺。
①TG(甲状腺球蛋白)。
②CT(降钙素)。
(5)甲状旁腺:PTH(甲状旁腺素)。 (6)胰岛。
①Insulin(胰岛素)。
②Glueagon(胰高糖素)。
③VIP(舒血管肠肽). ④PP(胰多肽). ⑤Someitostatin(生长抑素)。
⑥Gastrin(胃泌素)。 2.非激素标记物
(1)NSE(神经原特异性烯醇化酶). (2)CgA(嗜铬素A). (3)SY(突触素). 3.激素受体 （1）ER(雌激素受体）. （2）AR(雄激素受体）. （3）PR(孕激素受体). (九)细胞增殖标记物 1.PCNA(增殖细胞核抗原). 2 .Ki-67.
（十）黑色素标记物 1.S-100蛋白. 2.HMB45. 3 .Melanoma。
(十一）癌基因和（或）抑癌基因 1.bel-2. 2.c-erbB-2. 3.p53 4.p16(多肿瘤抑制基因)。 5.nm23。 (十二)病原体标记物
1.Myoeobaeterium Bovis(分枝杆菌，抗卡介苗)。 2.HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原). 3.HBcAg(乙型肝炎病毒核心抗原). 4.HPV(人乳头状瘤病毒) 5.HTLV-1(人类T细胞白血病病毒)。
