科研方法学
班级：2008级研3班 学号：2008128 姓名：段治华 艾滋病的实验室诊断方法
段治华
（山西医科大学，太原030001）
摘要:艾滋病是由人类免疫缺陷病毒感染引起的传染病，实验室检测是诊断艾滋病的主要手段，检测项目包括HIV抗原和抗体检测，病毒载量检测，CD4T淋巴细胞检测，HIV耐药性检测，基因芯片技术的运用，病毒分离等。近年来，基于分子生物学和免疫学方法的发展，HIV的实验室检测有了较大的进步，为艾滋病的准确诊断提供可靠的方法。
关键词:艾滋病 HIV 实验室诊断
艾滋病是获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS) 的英文音译，由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV) 感染引起的以免疫功能缺陷为主要特点的传染病[1]。目前在我国，艾滋病的流行已进入快速增长期，要有效地预防和控制艾滋病的流行，必须有可靠的诊断方法快速准确地诊断艾滋病。目前，艾滋病的诊断主要依靠实验室检测方法，近年来，基于分子生物学和免疫学方法的发展，HIV的实验室检测有了较大的进步。现简单叙述目前采用的实验室诊断HIV的方法。
1 HIV结构特点
人类免疫缺陷病毒（HIV）外型呈球形或卵形，直径90～130nm，病毒特有的蛋白质附着于一薄层类脂质构成其包膜。核心含有两条相同拷贝的RNA 链，外周核膜由多种蛋白质形成。HIV属逆转录病毒，基因组中存在三个大的开放读框，其顺序是gag-pol-env。Gag基因编码55KD的前体蛋白，在病毒成熟过程中，被pol基因编码的蛋白酶加工，分别产生核心蛋白P
17、核壳蛋白P24和核酸结合蛋白P15 。P24是核壳组成蛋白，构成病毒的核衣壳，它的结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。在HIV-2与P24对应的是主要核心抗原P32，为HIV-2型病毒感染的特异标志。Env编码包膜蛋白，由外膜糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白 1 gp41组成(在HIV-2型病毒中与之相当的是gp110/ 130和gp36) [1]。
2 HIV抗原检测
检测P24抗原可作为早期特异性诊断，因为在HIV感染的早期，血中未出现HIV抗体，血P24抗原常以低水平出现，但是该抗原检出率远比HIV 抗体为低，因为HIV 抗原出现不久即可产生抗体，抗原抗体以复合物形式存在，而游离很少。在感染后期，抗原再度升高，可作为HIV活动性感染的标志。P24抗原检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫(RIA)、免疫荧光技术(IFA)、免疫吸附电镜(ISEM)等，其中ELISA操作简单、经济、省时高效的实验方法，具有良好的敏感度和特异度 [2]。HIV抗原检测的灵敏度约50% ～ 80%，所以该结果只能作为HIV 感染的辅助诊断依据[3]。
3 HIV抗体检测
3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA为HIV抗体初筛最常用的筛检方法，其试剂已经发展到第4代[3]。
3.2 凝胶颗粒凝集试验（PA） 此法快速、简便，适合对少量标本的检测，但是灵敏度和准确性不如ELISA法[1]。
3.3 金标快速反应试验 将颗粒凝聚法的简便性和酶免疫测定(EIA)技术相结合，用于快速检测抗-HIV，特异性较好，试剂稳定，检测时不需要任何设备，快速简便，适用于应急检测以及边远地区检测[1]。
3.4 尿液HIV抗体检测 尿液检测已成为艾滋病检测的一种全新手段，在安全、便捷等方面更具优势。HIV感染者的尿液、唾液、精液及泪液中均含有HIV抗体，其HIV抗体主要成分为IgG[3]。
3.5 免疫斑点印迹试验（western blot，WB） 此法被称为抗-HIV检测的“金标准”。 是将HIV病毒蛋白通过十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳把分子量大小不等的蛋白带分离开来,再把这些已经分离的不同蛋白转移到醋酸纤维素膜上,再将此膜切割成条状，每一条醋酸纤维素薄膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。待检血清样本用稀释液稀释成1∶100 ，把它直接加到醋酸纤维素膜上，恒温振荡，使其充分接触反应。血清中若含有抗-HIV，就会与膜条上的抗原结合，冲洗除去多余的抗体，再加入抗人-IgG酶结合物并孵育，经洗涤后加入底物，有反应的抗原抗体结合带呈现紫褐色，根据出现条带情况判定结果[1]。
2 3.6免疫荧光 将HIV感染的细胞作为抗原固定在玻片上，滴加待检血清，若含有HIV抗体，则与细胞膜上的病毒抗原结合，清洗后加荧光标记的抗人IgG，细胞膜染色为HIV抗体阳性。此法操作简便，敏感性及特异性均较ELISA法高，但存在对某些血清非特异性荧光难以去除，结果判断需较高级的荧光显微镜等缺点[3]。
3.7放射免疫沉淀试验 用同位素标记的HIV蛋白与待检血清反应，若血清中含有HIV抗体即可与HIV蛋白抗原结合，再加入葡萄球菌蛋白A，经低速离心，然后将沉淀复合物分离后电泳，放射自显影观察同位素标记蛋白带即可判定。本法灵敏度和特异度均好，但因试剂制备复杂，成本高，且同位素操作需要严格防护而限制其应用[3]。
4 HIV 病毒载量检测
HIV病毒载量是指体内病毒复制的数量，一般以血清HIV-RNA表示，随着生物技术的发展，HIV病毒载量检测得到人们越来越多的重视，它可以直接检测HIV-RNA，可在发现血清学变化之前检测HIV感染，而且比P24抗原检测方法更灵敏，主要以RNA的拷贝数表示。检测方法有聚合酶链反应检测法，分枝DNA信号扩增检测法，核酸序列扩增实验。
[1]5 CD4T淋巴细胞计数
CD4T淋巴细胞是人体免疫系统最重要的细胞之一，HIV主要侵犯CD4T淋巴细胞，导致其数量减少和功能缺陷，使机体免疫功能低下，导致各种机会感染和肿瘤。CD4T淋巴细胞计数是AIDS诊断、疾病分期、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案的实验室标准指标。目前对CD4T淋巴细胞计数有手工操作法和自动检测法。流式细胞仪是目前最好的自动检测方法[1]。
6 HIV耐药性检测
耐药性是指病毒对某种药物敏感性降低,药物抑制50%或90%病毒生长的浓度上升几倍或几十倍[4]。
6.1 基因型检测 原理为利用RT-PCR技术对HIV-1 病毒的POL基因区(蛋白酶区和逆转录酶区)序列进行反转录扩增(手工或自动仪器方法)，通过基因测序技术获得序列信息，与全球HIV耐药基因数据对比分析耐药位点，得出耐药结果。 3 这种检测方法历时较短、费用较低，技术也相对容易[5]。
6.2 表型耐药检测 就是利用体外药敏分析方法，在逐渐增加的药物浓度下对HIV-1复制能力进行直接的评价。其结果以50%抑制浓度来表达(IC50)，并与野生株的IC50或临界值(cut-off值)相比，通过其倍数改变(fold change)来评估其耐药程度[4]。该试验耗时且价格昂贵、技术要求高[5]。
7 基因芯片技术
HIV基因芯片技术是把PCR技术和核酸分子杂交技术完美结合。是在厘米见方的固相载体上，将基因以微点阵的形式排列，应用核酸杂交的原理来检测未知基因，具有操作简单、自动化程度高、检测靶分子种类多、成本低、结果客观性强等特点[1]。
8 病毒分离培养
人体感染病毒后，便会终生携带。HIV广泛存在于人体的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、组织、血液和其他体液中，从这些材料中分离培养HIV，可用于HIV感染的辅助诊断，以及研究HIV在人群中的分布、变异和耐药情况。HIV病毒分离需要在P3级生物安全实验室进行，实验条件要求高[1]。
总之，对HIV检测方法分析将有助于HIV的早期诊断，避免漏检，也有助于对治疗艾滋病药物的疗效评价、预测和监测疾病进程，提高检测的灵敏性，从而缩短检测的窗口期。随着对人类HIV/AIDS 研究的深入以及其他生物技术的发展，为HIV的检测提供更快更可靠的方法，为诊断和治疗艾滋病提供技术支持。
[参考文献] [1] 潘云.AIDS的实验诊断[J],右江民族医学院学报,2007,1:110-111.[2] 熊祝嘉.ELISA检测p24抗原用于诊断HIV感染的研究现状[J],实用医技杂志,2007,14(2):116-117.[3] 白浪,雷秉钧.HIV/AIDS实验室检测及其研究进展[J],中国循证医学杂志,2008,8(3):206-209.[4] 鲁俊锋,李珏,李敬云,吴昊.HIV的表型耐药及检测方法的研究进展[J],中国病原生物学杂志,2008,3 (1):65-66.[5] 康来仪.HIV/AIDS目前实验诊断方法及其价值[J], 诊断学理论与实践,2007,6(3):187.
