第二章 微波辐射下壳聚糖制备工艺探讨
第二章 微波辐射下壳聚糖制备工艺探讨
2．1 前言
甲壳素是虾壳、蟹壳以及昆虫外壳的主要成分，其化学名为(1,4)—2—乙酰氨基—2—脱氧—D—葡聚糖。由于分子间强大的氢键作用，甲壳素几乎不溶于任何溶剂，其应用受到很大限制。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物，其溶解度大大提高。由于壳聚糖中游离氨基的存在，赋予了它很多潜在的性能；而且由于壳聚糖分子中活性基团的增加，大大提高了它的反应性能，可发生多种改性反应，并广泛用于化妆品、食品、医药、造纸等工业中。
目前，壳聚糖的制备方法有：酸碱法、微波法、酶催化法等。如曹根庭等利用连续浸酸法获得高粘度、高脱乙酰度壳聚糖[14]；张亦飞将甲壳粉碎后用酸碱法制备壳聚糖[15]；骆鑫等利用回流碱处理的方法对壳聚糖制备工艺进行了改进[16]等。这些方法一般都可得到脱乙酰度达80%以上、颜色雪白的壳聚糖。但是其处理时间往往较长，而且过长时间的碱处理容易引起壳聚糖的降解，使粘度降低。微波具有加热速度快、能耗低、安全清洁等特点。本文尝试以微波加热作为加热手段，并考虑生产成本等因素，以虾壳、蟹壳作为原料，在经过脱蛋白、脱钙、脱色等一系列前处理之后，用浓碱脱去壳聚糖的乙酰基，即可得到壳聚糖产品。并且通过研究所得产品的脱乙酰度、溶解性等性质，以确定微波加热制备壳聚糖的生产工艺。
2．2 实验部分
2．2．1 实验试剂和仪器
Galanz17L机械型微波炉（广东格兰仕公司）； 氢氧化钠（化学纯，广东石岐化工厂）； 浓盐酸（分析纯，广州市东红化工厂）； 高锰酸钾（化学纯，广州化学试剂厂）； 草酸（化学纯，广东台山化工厂）； 丙酮（分析纯，广州化学试剂厂）； WMZK-01温度指示控制仪； 乌氏粘度计； 超级恒温槽
华南理工大学学士学位论文
2．2．2 实验内容
2．2．2．1 脱蛋白
将一定质量食用过并且洗净的虾壳、蟹壳置于70ml浓度为1mol·l-1的NaOH溶液中，然后放入微波炉中，在280W微波功率下加热10min。冷却，过滤。将滤渣重复以上操作几次，直至溶液近于无色。即可水解除掉大部分蛋白质、脂肪等。
2．2．2．2 除钙
将除去蛋白的虾壳、蟹壳洗涤干净后，置于70ml浓度为1mol/L的盐酸溶液中，在室温下浸泡12小时，将其中的碳酸钙溶解。必要时可以将旧酸过滤掉，换上新鲜的酸液继续浸泡，直至无气泡生成为止。 2．2．2．3 脱色
将经过1，2步处理的原料用2%的KMnO4溶液浸泡1h，然后过滤，将壳洗涤干净后，再用2%的草酸溶液在50℃下还原，即可制得颜色洁白的甲壳素。洗涤，干燥，称量所得甲壳素的质量。 2．2．2．4 脱乙酰基
将制得的甲壳素置于一定浓度的浓NaOH溶液中，在微波炉中加热脱乙酰基。反应结束后，过滤，洗涤，即可得到壳聚糖产品。洗涤，干燥，称重。计算产率。
2．2．2．5 脱乙酰度的测定
壳聚糖分子中的游离氨基具有阳离子的性质，与酸可以发生定量反应。因此可通过定量的酸与氨基反应，然后再用碱反滴过量的酸。用甲基橙作指示剂，当溶液颜色由红变橙黄色时即为终点[17]。
准确称取0.5g干燥的壳聚糖样品，置于250ml锥形瓶中，加入0.3mol/lHCl标准溶液20ml,振荡使之溶解。加入1~2滴甲基橙指示剂，然后用0.1mol/lNaOH标准溶液滴定过量的盐酸，直至终点。计算壳聚糖的脱乙酰度。
脱乙酰度计算方法推导如下：
所谓壳聚糖的脱乙酰度，即甲壳素经脱乙酰化后，一部分转化为壳聚糖，这部分被转化的甲壳素的质量占所有甲壳素的质量的百分比。
设被测壳聚糖的质量为m(g)，滴定中—NH2所消耗的标准盐酸的量即为：(c1V1-c2V2)/1000，用a表示。则这部分m(g)壳聚糖换算成相应的甲壳素的质量应为：m’ =m +42a；而已脱去乙酰基的壳聚糖换算成相应的甲壳素的质量应为：m’’=203a。m’’在m’中所占的百分数即为壳聚糖的脱乙酰度。即：
DD(%)（脱乙酰度）=203a/(m +42a)×100 其中：c1：标准盐酸溶液的浓度；c2：标准氢氧化钠溶液的浓度；
V1：标准盐酸溶液的体积；V2：消耗的标准氢氧化钠溶液的体积（以
ml计）；
42为—COCH2的式量；203为甲壳素中结构单元的式量。 2．2．2．6 壳聚糖溶液粘度的测定
称取0.2g壳聚糖样品于烧杯中，加入5%乙酸溶液20ml。搅拌使其溶解，然后移入容量瓶定容。在25℃下，用乌氏粘度计测定粘度。 2．2．2．7 壳聚糖灰份含量的测定
先将洁净干燥的坩埚恒重，在坩埚中称取0.2克左右的壳聚糖，在普通电炉中烤至碳化，然后放入高温电炉，在550℃±20℃灼烧3h,取出，在空气中冷却
第一章 绪论
1min，再在干燥器中冷却30min，称重。称重后放入电炉中灼烧1h,冷却，称重。两次质量之差小于0.001g为恒重 [18]。按下式计算灰分：
灰分/%=（W2-W0）/(W1-W0)*100 式中：W0——已恒重的空坩埚质量，g； W1——坩埚加样品质量，g；
W2——灰化后坩埚加灰分质量，g。 2．2．2．8 壳聚糖水份含量的测定
称取0.2g壳聚糖样品，在105℃下烘干4h至恒重，计算失重，即得水分[18]。
水分/%=（W1-W2）/(W1-W0)*100 式中：W1——105℃烘干前样品及称样皿质量，g； W2——105℃烘干后样品及称样皿质量，g； W0——已恒重的称样皿质量，g。 2．2．2．9 壳聚糖溶解性的测定
在10ml5%的乙酸溶液中，慢慢地加入壳聚糖，不断搅拌使其溶解，直至液体完全变成凝胶。称量所溶解的质量。 2．2．2．10 传统加热方法制备壳聚糖
将甲壳素置于45%的NaOH溶液中，使用电炉加热，并且控制加热温度在100℃左右，进行脱乙酰基。测定所得产品的脱乙酰度，并同微波加热所得产品的脱乙酰度进行比较。
2．2．3 实验结果与讨论
2．2．3．1 壳聚糖的红外光谱解析
图2-1 微波制备壳聚糖红外光谱图（自制）
Fig.2-1 IR spectrum of chitosan under microwave irradiation 11
华南理工大学学士学位论文
图2-2 生化试剂级壳聚糖红外光谱图
Fig.2-2 IR spectrum of chitosan of biochemical reagent Fig.2-1为用微波法自制壳聚糖的红外光谱图。其中3380cm-1处为羟基、氨基的伸缩振动峰；2878cm-1处为C—H伸缩振动峰；1564cm-1处为N—H变形振动峰；1073cm-1处为β—D-吡喃葡萄糖苷的特征峰；1155~1000cm-1处为C—N吸收带；16
58、1318cm-1处为残余乙酰基的吸收峰。Fig.2-2为上海源聚生物科技有限公司生产的生化试剂级壳聚糖的红外光谱图。对谱图进行比较可知，这两张谱图的特征峰位置都是类似的。不同的是生化试剂级壳聚糖的氨基伸缩振动峰较为强烈；自制壳聚糖的残余乙酰基吸收峰较为尖锐，这是由于生化试剂级壳聚糖比自制壳聚糖的脱乙酰度要高的缘故。 2．2．3．2 壳聚糖的X射线衍射谱图
5101520253035402θ()0
图2-3 微波制备的壳聚糖（自制）X射线衍射谱图 Fig.2-3 XRD of chitosan prepared under microwave irradiation 12
第一章 绪论
5101520253035402θ()0
图2-4 生化试剂级壳聚糖X射线衍射谱图 Fig.2-4 XRD of chitosan of biochemical reagent Fig.2-3为微波辐射自制壳聚糖的X射线衍射谱图。和Fig.2-4比较，它们在2θ=110和200附近均出现尖锐的衍射峰，说明它们都具有很高的结晶度。从2θ=110附近出现衍射峰判断，所获得的壳聚糖属α-型壳聚糖。
2．2．3．3 壳聚糖的产率和技术指标
分别以洗净的虾壳和蟹壳为原料，在经过一系列的前处理后，用50%的NaOH溶液于280W微波功率下加热10min，得到壳聚糖产品。洗净，称量所得产品产量和有关质量指标。有关实验结果如下表2-1所示：
表2-1 壳聚糖的产率和技术指标
Table 2-1 The yield percentage and technical indexes of chitosan
原料/g 甲壳素壳聚糖产率灰份水分颜色
产量/g 产量/g （%） （%） （%）
虾壳为10 1.14 0.61 6.1 0.16 3.85 白色 原料 蟹壳为10 1.57 0.96 9.6 0.87 8.99 褐色 原料
由上表可知，所制得的壳聚糖产率和文献记载的壳质中甲壳素的组分含量（10%-25%）相差不大，说明微波加热制备壳聚糖是可行的。蟹壳中壳聚糖的含量稍大于虾壳，但是由蟹壳制得的壳聚糖颜色较差。这可能是由于蟹壳较厚，蛋白质难以处理干净，因此在浓碱处理时，残余的蛋白质发生变性的缘故。此外，由虾壳制备的壳聚糖的其它技术指标均优于由蟹壳制备的壳聚糖。且作者在湛江一带调查得知，虾壳的来源远丰富于蟹壳，价格也低廉的多。因此在工业化中，宜选用虾壳作为原料。
2．2．3．4 碱液浓度对壳聚糖脱乙酰度的影响
在实验中，固定使用280W功率进行加热，加热时间为10min。改变碱液浓度，研究脱乙酰度的变化，以便确定适宜的碱液浓度。结果如图2-5所示：
华南理工大学学士学位论文
壳，%）壳聚糖脱乙酰度（虾908070605040302010203040506070碱液浓度（%）
图2-5 碱液浓度对壳聚糖脱乙酰度的影响
Fig.2-5 Effects of concentration of NaOH to deacetylation degree of chitosan
由上图可知，随着碱液浓度的提高，壳聚糖脱乙酰度也随之提高。当碱液浓度达55%时，脱乙酰度已达70%以上。酰胺键的断裂需要在浓碱溶液中进行，但是如果碱液浓度过大，会导致产品变黄，色泽暗淡。此外，壳聚糖是一种天然高分子多糖，在酸或碱的催化作用下，都容易发生水解。因而如果碱液浓度过大，会引起壳聚糖分子链断裂而降解，从而导致产品粘度指标下降。 2．2．3．5 微波加热时间对脱乙酰度的影响
选择碱液浓度为45%，微波加热功率依然为280W，改变微波加热时间。研究了微波加热时间对脱乙酰度的影响。
85壳聚糖脱乙酰度（%）8075706560555046810121416182022碱液处理时间(min)
图2-6 微波加热时间对脱乙酰度的影响
Fig.2-6 Effects of heating time by microwave to deacetylation degree of
chitosan
由图中数据可知，随着加热时间延长，壳聚糖脱乙酰度也随之增大。开始时，反应较为迅速，脱乙酰度提高较快。当加热时间达到15min时，脱乙酰度已经接近80%。继续加热至20min，脱乙酰度也会有缓慢提高。但是根据作者实验情况，
第一章 绪论
当加热时间为20min时，产品的粘度下降极大，使产品的质量下降。这是因为碱液处理时间过长，也会引起壳聚糖分子链断裂而降解，变成低聚壳聚糖。因此，在本实验条件下，NaOH浓度为45%，加热时间为15min为宜。 2．2．3．6 微波加热时间对壳聚糖粘度的影响
作者对固定碱液浓度在45%，微波功率为280W，通过改变脱乙酰基时间所获得的一系列产品测定了它们的粘度。有关结果反映如下：
2.22.01.8对粘度相1.61.41.21.046810121416182022脱乙酰基时间(min)
图2-7 脱乙酰基时间对壳聚糖粘度的影响
Fig.2-7 Effects of deacetylation time to the relative viscosity of chitosan
粘度测定温度：20℃
由上图可知，在加热至15min之前，随着反应时间延长，壳聚糖粘度只是略微下降。这说明此时壳聚糖降解程度不高，反应时间对壳聚糖粘度影响不大。而传统加热法脱乙酰基时，随着加热时间的延长，产物的粘度迅速下降。相比较传统加热方法，微波加热可有效防止壳聚糖的降解，获得高粘度的壳聚糖。这是微波加热的一个优点。当加热时间延长至20min，产物粘度迅速下降，此时壳聚糖降解迅速。一般而言，壳聚糖脱乙酰度越高，其粘度越小[19]。因此如果要制备高粘度的壳聚糖，本反应应控制碱液的处理时间15min为宜。 2．2．3．7 壳聚糖的溶解性
对于脱乙酰度较低的壳聚糖而言，由于其分子的某些部位几乎没有脱乙酰化，分子间存在着氢键作用，依然是有序结构。这种壳聚糖在5%的乙酸溶液中只能溶胀，不能溶解。而脱乙酰度高的壳聚糖，由于有游离胺基的存在，其溶解性大大改善。作者在本实验中制备的壳聚糖在5%的乙酸溶液中都具有良好的溶解性。当溶解在乙酸溶液中直至形成凝胶时，由虾壳制得的壳聚糖溶解度可达0.06g/ml以上，由蟹壳制得的壳聚糖溶解度可达0.1g/ml以上（室温）。 2．2．3．8 传统方法加热时间对脱乙酰度的影响
为了便于比较，作者还使用传统加热手段对甲壳素进行了脱乙酰化。固定
华南理工大学学士学位论文
NaOH浓度为45%，加热温度为100℃，加热时间分别为1h,2h和3h。所测定得的脱乙酰度如下图所示：
848280脱乙酰度（%）78767472706866641.01.52.02.53.0加热时间（h）
图2-8 传统加热手段加热时间对壳聚糖脱乙酰度的影响
Fig.2-8 Effects of heating time to deacetylation degree of chitosan by traditional
heating method 由图中数据可知，使用传统加热手段，当加热时间为1h时，壳聚糖的脱乙酰度仅为64.6%；当加热时间延长至3h，其脱乙酰度也仅仅超过80%。和微波加热相比较，微波加热速度比传统加热速度提高了10倍以上。这是由于微波加热机理和传统加热不同。微波加热是一种“体加热”方式，它是借助分子偶极矩的不断旋转而在物质内外同时加热。而传统加热手段则是依靠传导和辐射等方式由物质表面向内部进行加热。因此，微波加热速度远远大于传统加热速度。这是微波加热的一个显著优点之一。它既提高了加热速度，又降低了能耗，是一种清洁环保型的能源。
2．3 本章小结
（1）通过微波加热脱蛋白、除钙、脱色等一系列前处理后，在浓碱溶液中，，利用微波加热脱乙酰基，可以获得高脱乙酰度、高粘度的壳聚糖产品。在本实验中，作者通过研究加热时间、碱液浓度对壳聚糖脱乙酰度、粘度等性质的影响，初步认为微波加热制备壳聚糖的适宜工艺为：碱液浓度45%；微波加热15min；微波功率280W。此工艺设备简单，操作简易，具有较强的推广性。.（2）通过和传统加热手段制备壳聚糖的方法进行比较，发现微波大大促进了甲壳素的脱乙酰化反应，加热效果大大提高。作者认为其中既有微波的“致热效应”、又有微波的“非致热效应”起作用的结果。微波对甲壳素脱乙酰化反应的具体作用机理还有待进一步深入的研究。但是通过本实验可知微波是一种高效，洁净的能源，可大大提高化学反应速度。
