微生物限度检查方法验证
微生物限度检查方法验证报告目录
1.验证目的
2.验证小组及职责分工
2.1验证小组
2.2职责分工
3.验证程序
4.验证结论及综合评价
1.验证目的
确认所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该药品的微生物限度检查。
2.验证小组及职责分工 2.1验证小组
组长：分析中心主任
小组成员：GMP（）、微生物室（）、质量管理部（） 2.2职责分工
组长：负责验证期间各部门的协调及整个验证过程的具体实施。
分析中心（微生物室）：负责验证方案的起草及具体实施，确保验证过程能按方案规定的程序进行，对各种验证资料（验证结果）应及时交与GMP组相关人员整理。
GMP组：负责验证方案的编写规范；负责各种验证资料（检查结果）的收集整理及结果的审核；审查验证报告及发放验证报告。
质量管理部：参与验证方案的编制；负责验证方案的审核及批准；负责出具检验报告；并对微生物限度检查环境进行检测；负责验证文件的管理。
3．验证内容
3.1品种：XXXX口服溶液；批号：。
3.2方法：微生物限度检查方法验证（《中国药典》2005年版）。3.3计数方法的验证 3.3.1 验证试验用菌种：
验证试验用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
a.大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 26 003〕
b.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〔CMCC(B) 26 003〕 c.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 〔CMCC(B) 63 501〕 d.白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕 e.黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F)98 00 3.3.2菌液制备：
取经30～35℃培养18～24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5～10－7约为50～100cfu/ml备用。
取经23～28℃培养24～48小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5约为50～100cfu/ml备用。
取经23～28℃培养5～7天的黑曲霉斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液3～5ml，
洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中10倍稀释至10－4约为50～100cfu/ml备用。
3.3.3 供试液制备
吸取样品10 ml，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液90ml浓度均为1：10供试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株。
3.3.4培养基稀释法
采用加0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供试液，再加15~20 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~48小时观察结果细菌计数，测定回收率。结果见表：
3.3.5回收率测定：
(1) 试验组: 分别取不同品种的1：10供试液1ml、50~100个/ ml 试验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌.(2) 活菌组 测定每一菌株的试验菌数 (3) 供试液对照 测定供试品本底菌数 (4) 稀释剂对照组 3.6结果
菌落计数结果、常规法和培养基稀释法的验证结果按表
1、2和表3填写。
表1菌落计数（cfu/ml）
实验次数
1 2
3金黄色葡萄球菌
10-5 9
4、90 80、74 1
53、150
枯草杆菌 白色念珠菌 10-5 130、80
45、23 7
8、77
10-5 7
3、72 1
28、108 7
3、7
4黑曲霉 10-4
110、90
110、120
110、100
大肠埃希菌
10-7
14、15
54、34 30、27
检查人：日期：
表2XXXX口服溶液微生物限度检查方法验证 （常规法）
实验次数
1 2 3结论：
（1）采用常规方法检验XXXX口服溶液溶液供试品，人工污染5株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均高于70%，可采用常规方法检验。
人工染菌回收率%
金黄色葡萄球菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉
0.02 29.2 抑菌
71.4 29.4 抑菌
81.1 100.0 100.0
100.0 100.0 100.0
大肠埃希菌
100.0 100.0 100.0
（2）XXXX口服溶液对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有不同程度的抗菌活性，供试品回收率为0.02~29.2%，均低于70%。
检查人：日期：
表3XXXX口服溶液微生物限度检查方法验证 [培养基稀释法（1ml加2个平皿）]
实验次数
1
2结论：
采用培养基稀释法可消除供试品对人工污染金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑菌作用。回收率达到70%以上。因此，培养基稀释法（0.5ml/皿）可用于XXXX口服溶液的微生物限度检查。
人工染菌回收率%
金黄色葡萄球菌
80.7 91.
4枯草杆菌 100.0 100.0
检查人：日期： 3.7结论
根据验证试验结果，确定XXXX口服溶液微生物限度检查法为细菌数测定可采用培养基稀释法（0.5ml/皿）测定，霉菌数可采用常规法测定。
检查人：日期： 3.4控制菌检查方法的验证 3.4.1 验证试验用菌种：
验证试验用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
a.大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44 102〕b.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 c.乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B) 〔CMCC(B) 50 094〕 d.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B) 10 104〕 e.生孢梭菌(Clostridium sporogenes) 〔CMCC(B)64 941〕 3.4.2菌液制备：
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物到硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
3.4.3 供试液制备
吸取样品10 ml，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液90ml浓度均为1：10供试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株。
3.4.4验证方法
(1) 试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中
(2) 阴性菌对照组
设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。
3.4.6结果
试验组检出控制菌，阴性对照组未检出。
检查人：日期： 3.4.7结论
根据验证试验结果，确定XXXX口服溶液的控制菌检查可采用常规法测定。
检查人：日期：
