食品卫生微生物检验实验室操作技术要求
第一节实验室管理制度
一、实验室管理制度
1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度，药品管理、使用制度，玻璃器皿管理、使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。
3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修，严禁在冰箱内存放和加工私人食品。
4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出。5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水电，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。
6．负责人严格执行本制度，出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。
二、仪器配备、管理使用制度
1．食品微生物实验室应具备下列仪器：培养箱、高压锅、冰箱、显微镜、超净台、普通天平、干燥箱、均质器、恒温水浴箱、菌落计数器。
2.实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求，保证准确可靠，凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。
3．实验室仪器安放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查，精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动，应写出报告，通知管理人员，由经理同意填报修理申请，送仪器维修部门。
4.各种仪器（冰箱、温箱除外），使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后，方可离去。5．一切仪器设备未经设备管理人员同意，不得外借，使用后按登记本的内容进行登记。
6．仪器设备应保持清洁，一般应有仪器套罩。
7．使用仪器时，应严格按操作规程进行，对违反操作规程的因管理不善致使仪器损坏，要追究当事者责任。
三、药品管理、使用制度1．依据本室检测任务，制定各种药品试剂采购计划，写清品名、单位、数量、纯度、包装规格，出厂日期等，领回后建立账目，专人管理，每半年做出消耗表，并清点剩余药品。2．药品试剂陈列整齐，放置有序、避光、防潮、通风干燥，瓶签完整，剧毒药品加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。
3．领用药品试剂，需填写请领单，由使用人和室负责人签字，任何人无权私自出借或馈送药品试剂，本单位科、室间或与外单位互借时需经实验室负责人签字。
4．称取药品试剂应按操作规范进行，用后盖好，必要时可封口或黑纸包裹，不使用过期或变质药品。
四、玻璃器皿管理、使用制度1．根据测试项目的要求，申报玻璃仪器的采购计划、详细注明规格、产地、数量、要求，硬质中性玻璃仪器应经计量验证合格。2．大型器皿建立账目，
每年清查一次，一般低值易耗器皿损坏后随时填写损耗登记清单。
3．玻璃器皿使用前应除去污垢，并用清洁液浸泡24 h后，用清水冲洗干净备用。
4．器皿使用后随时清洗，染菌后应严格高压灭菌，不得乱弃乱扔。
五、安全制度
1．进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。2．在进行高压、干燥、消毒等工作时，工作人员不得擅自离现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。3．严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方可离开现场。
4．工作完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用新洁尔灭、过氧乙酸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。
5．实验完毕，即时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理。6．每日下班，尤其节假日前后认真检查水、电和正在使用的仪器设备，关好门窗，方可离去。
六、环境条件要求1．实验室内要经常保持清洁卫生，每天上下班应进行清扫整理，桌柜等表面应每天用消毒液擦拭，保持无尘，杜绝污染。2．实验室应井然有序，不得存放实验室外及个人物品、仪器等，实验室用品要摆放合理，并有固定位置。
3．随时保持实验室卫生，不得乱扔纸屑等杂物，测试用过的废弃物要倒在固定的箱筒内，并及时处理。
4．实验室应具有优良的采光条件和照明设备。
5．实验室工作台面应保持水平和无渗漏，墙壁和地面应当光滑和容易清洗。
6．实验室布局要合理，一般实验室应有准备间和无菌室，无菌室应有良好的通风条件，无菌室内空气测试应基本达到无菌。
7．严禁利用实验室作会议室及其他文娱活动和学习场所。
第二节实验室技术操作要求
一、无菌操作要求
食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。
1．接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。2．进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及鞋子，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。3．接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。
4．进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。
5．从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。6．接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。
7．接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环或针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。
8．吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
二、无菌间使用要求
1．无菌间应设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进
入无菌间后传递物品。2．无菌间内应保持清洁，工作后用消毒液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。
3．无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外消毒车，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。
4．处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
三、消毒灭菌要求
微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。
（一）干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法
1．灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，用纱布包好。2．装放
（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。（2）高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。3．设备检查 （1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。
（3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。4．灭菌处理 (1) 干热灭菌法：此法适应于在干热情况下，不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。
a．器械器皿应清洗后再干燥，以防附着在表面的污物炭化。
b．灭菌时安放物品不能过挤，不要直接接触底和箱壁，物品之间留有空隙。
c．灭菌时将箱门关紧，接上电源，先将排气孔打开约30min，排除灭菌器中的冷空气，温度升至160℃调节指示灯，维持1.5 –2h。d．灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。(2)立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：
a．立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换）.
b．盖好顶盖拧紧，勿使漏气；立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放掉冷气（水沸腾后排气10-15min）。
c．关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。d．达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物；如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。5．灭菌温度与时间 (1) 干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。
(2) 压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见表1。
表1
物品灭菌时间
115℃121℃
不含糖等耐热物质培养基
含糖类等不耐热培养基染菌培养物器械器皿15-20min30min30min
（二）间歇灭菌方法
1．此灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。
（1）将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。（2）关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。
（3）灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。
2．煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15min，也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5min，加入0.02﹪甲醛，80℃煮60min均可达到灭菌目的，但选用煮沸消毒的增消剂时，应注意对物品的腐蚀性.
3．灭菌处理：灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查放置，以免再度污染。
(1) 物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无菌物品使用。
(2) 取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。(3) 培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。
(4) 启闭式容器，在取出时应将筛孔关闭。(5) 取出的物品掉落在地或误放不洁之处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。(6) 取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。
(7) 凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。(8) 每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。
四、有毒有菌污物处理要求 微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。1．经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。
2．经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。3．染菌后的吸管，使用后放入消毒液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30 min高压灭菌。
4．涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入消毒液中浸泡24 h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。
5．打碎的培养物，立即用消毒液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。
五、培养基制备要求
培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：
1．根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。
2．PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。
3．培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。
4．盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。
5．培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃
15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。
6．每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。
7．目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。
8．每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。
六、样品采集及处理要求
1．所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。
2．根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。
3．采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。
4．样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。
5．检验室收到样品后，进行登记（样品名称、送检单位、数量、日期、编号等），观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。
(1) 样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。
(2) 瓶、袋装食品已启开者，食品已折碎不完整者，即失去原食品形状者（食物中毒样品除外）。
(3) 按规定采样数量不足者。
对送检符合要求的样品，检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。
6．样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。
(1) 液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。
(2) 固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。
(3) 瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。
七、样品检验、记录和报告的要求
1．检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。
2．样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。
