九味羌活颗粒
微生物限度检查方法学验证报告 目的：对九味羌活颗粒微生物限度检查方法进行方法学验证。方法：采用平皿记数法，分组分别使用5种实验菌验证。菌液组分别取各实验菌液注入培养基中培养，供试品对照组取供试液注入培养基中培养，试验组取供试液加菌液注入培养基中培养。通过3次独立的平行试验，分别计算各试验菌每次试验的回收率。采用观察大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌在相同环境下的培养来验证控制菌的检查方法。
1.实验材料
供试品九味羌活颗粒我公司自己生产，（批号：1003001规格：15g/袋）培养基：营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）均由中国药品生物制品检定所购买。
稀释液：PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液。
菌种：细菌验证用菌种：枯草芽孢杆菌【CMCC(B)63 501】金黄色葡萄球菌【CMCC(B)26 003】 大肠埃希菌【CMCC(B)44 102】 霉菌验证用菌种：白色念珠菌【CMCC(F)98 001】黑曲霉【CMCC(F)98 003】以上菌种均由中国药品生物制品检定所购买，传代次数均未超过五代，采用菌种保藏技术，保证试验菌株的生物学活性。
2实验方法
2.1.细菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证
2.1.1.菌液制备
（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35℃～37℃培养18小时～24小时，取此培养液1ml至0.9%无菌氯化钠溶液9ml中，采用10递增稀释法，稀释至10-5 ～10-7 ，使菌液浓度为50cfu/ml～100cfu/ml。
（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23℃～28℃培养24小时～48小时，取此培养液1ml至0.9%无菌氯化钠溶液9ml中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5 ～
10，使菌液浓度为50cfu/ml～100cfu/ml。
（3）接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23℃～28℃培养5天～7天，加0.9%无菌氯化钠3ml～5ml洗下霉菌孢子，吸出孢子液，取1ml孢子液至0.9%无菌氯化钠溶液9ml中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4 ～10-6，使菌液浓度为50cfu/ml～100cfu/ml。
2.1.2.供试液的制备
取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪混匀，作为1:10的
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供试液。
2.1.3.验证试验
（1）菌液组：分别取菌液1ml,采用平皿计数法，测定上述制备好的菌液中每毫升的活菌数。
测定结果见表1。
（2）供试品对照组：取供试液1ml，采用平皿计数法。测定结果见表2。
（3）试验组：取供试液1ml和50cfu～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数，测定结果见表3，计算回收率见表4。
将上述用于细菌计数倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30℃～35℃培养48小时观察结果，霉菌和酵母菌计数倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置23℃～28℃培养72小时观察结果。
表1菌液组菌落计数（cfu/皿）
由表可知该供试品对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌的回收率均高于70%。经上述对细菌、霉菌及酵母菌计数方法和记录审核，验收小组意见是本计数方法适合九味羌活颗粒的细菌、霉菌及酵母菌的计数方法。 2.2控制菌检查 2.2.1.菌液制备
接种大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35℃～37℃培养18小时～24小时，取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5 ～10-7，使菌液浓度为10cfu～100cfu
2.2.2.供试液的制备
取本品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，制成1:10的供试液。 2.2.3验证试验
大肠埃希菌检查方法的验证：
（1） 供试品组：取供试液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，置35℃～37℃培养2
4小时。
（2） 空白对照组：取与供试液等量的稀释液加至胆盐乳糖培养基100ml中，置35℃～37℃
培养24小时。
（3） 阴性菌对照组：取供试液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，加入金黄色葡萄球
菌10cfu～100cfu，置35℃～37℃培养24小时。
（4） 阳性菌对照组：取供试液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中,加入大肠埃希菌
10cfu～100cfu,置35℃～37℃培养24小时。
取上述培养物各0.2ml，分别加入含5ml的4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）试管中，置35℃～37℃培养5小时～24小时。观察结果，见表7。
表7大肠埃希菌检查结果
表7结果显示，阳性菌生长良好，表明本品在该条件下对大肠埃希菌的抑制作用可以忽略不计；阴性菌均为检出，表明该控制菌检查方法的专属性好，说明采用常规法进行本品的大肠埃希菌检查可行。
综上所述，上述拟定的方法草案可行。 4.确定的微生物限度检查方法
微生物限度取本品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，制成1:10的供试液。采用10倍递增稀释法，稀释至10-3 ，细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平皿法，分别取每稀释级的供试液1ml，倾注于2个平皿中，依法检查（中国药典2005年版一部附录XⅢC）。 大肠埃希菌检查采用常规法，依法检查（中国药典2005年版一部附录XⅢC）。1g供试品中，细菌数不得过1000个，酵母菌和霉菌数不得过100个，大肠埃希菌不得检出。 5.供试品的检查
按照上述确定的微生物限度检查方法检验供试品，结果符合规定，见表8
表8供试品检验结果
6结论：
根据验证试验结果，确定九味羌活颗粒的细菌、霉菌和酵母菌数采用平皿法测定，控制菌大肠埃希菌检查采用常规法测定。
