MET基因复制数量的增加赋予单克隆抵抗体抗MET的能力并且建立药物依赖性
关键词：MET ，MV-NV30单克隆抗体，酪氨酸激酶抑制剂，抗性，药物依赖性 【摘要】：被MEI原癌基因编码的酪氨酸激酶受体领导了具体抑制剂的发展并在癌症中起很重要的作用，其中现在一些正处于前进的临床试验阶段就以前的经验表明对大多数靶向治疗最主要的限制是抗性的出现。在对MET单克隆抗体抗性和抗体对化学抑制剂旁路抗性（反之亦然）一无所知时，酪氨酸激酶抑制剂对MET的抗性机制就已经被提出。EBC1型肺癌细胞是MET基因扩增的结果，并且这种细胞对MET抑制剂非常敏感，包括MET单克隆抗体的单机形式在内。我们培养生成抵抗抗体的细胞发现这种抗性是由于MET基因大量复制扩增和它的受体显著表达而来。这种过度表达可以使单克隆抗体的“脱落”活动达到饱和，并且能够防止表面的MET受体的有效的下调和抑制剂的活化作用。值得注意的是MV-DN30抗体的抗性细胞是MET耐受细胞对MET酪氨酸激酶抑制剂也很敏感。除此之外，抗体抗性细胞还具有药物依赖性,MV-DN30的去处导致它们死亡是由于它们的过度信号表达。在实验中，对MET酪氨酸激酶抑制剂存在抗性的细胞仍然对MV-DN30抗体的作用敏感。结果表明一种不连续的通过抗体和化学激酶抑制剂联合治疗可能会使靶向治疗的临床反应和对MET抗体治疗旁路的抗性增加。
缩略语：MV-DN30--单价DN30，TKEs—酪氨酸激酶抑制剂，HGF—肝细胞生长因子，MAPK—有丝分裂原活化蛋白激酶 1.简介
可以抑制一个特定的目标分子化合物的靶向治疗法开辟了治疗癌症的新道路。与主要杀死扩散细胞为主的传统化疗不同的是靶向药物对肿瘤细胞采取一种更具体的治疗方式。靶向治疗依赖于“癌基因沉瘾”的概念。这就意味着单个基因的抑制或死亡是由于它们的沉瘾，或者至少抑制它们的生长（温斯坦,2002）。临床试验中的特定抑制剂的发展给肿瘤细胞的“Achille’s heel”的识别提供支持（温斯坦和乔，2006）。
尽管靶向治疗在一部分癌症患者中取得了较优异的效果，还有重要的一点就是部分癌症病人对药物的选择表达没有起到治疗作用（原发性），除此之外，几乎总是一开始患者反应变成后来对治疗的抵抗和复发（继发性）。因此，最关键的就是要发现对治疗抵抗的机制并且找到绕过它们的方法。
癌基因和人类癌症密切相关，酪氨酸激酶起着决定性作用。这个观察发现许多肿瘤沉溺其中使得蛋白激酶成为了治疗癌症的理想目标（巴塞尔加，2006; Gschwind等人，2004）。在临床诊断中主要使用一种较小的激酶抑制剂和单克隆抗体来抑制酪氨酸激酶。酪氨酸激酶抑制剂是一种可以抑制靶蛋白酶活性的小分子物质。它们能有效地瞄准膜结合位点和细胞内的激酶并且很容易在体内扩散。单克隆抗体已被广泛用于临床并取得了可观的成果。这些分子的优点在于它们具有很高的特异性。在癌症治疗中的可以抗癌的RTKs单克隆抗体已经被批准在乳腺癌和结肠癌中使用(分别针对HER2和表皮生长因子受体) 并可作为抗血管增生的药物（针对血管内皮生长因子受体）。除此之外，很多针对于其他目标的单克隆抗体正处与发展和试验阶段。最近，一种作为癌症治疗目标的RTK受到关注，这种RTK是由致癌基因编码的在肝细胞生长因子上的酪氨酸激酶受体。在和肝细胞生长因子结合后，MET活化并启动一个复杂的生化程序，这个过程被称作“浸润性上长”。在肿瘤组织中，浸润性生长的增进可以迫使肿瘤细胞从肿瘤组织中分解下来侵蚀基底膜，渗入基质中，甚至定居于新的组织中来实现转移。很多研究结果表明MET在人类的许多肿瘤中具有活性，并且它与对直接激酶疗法的持续抗性密切相关。除此之外，还表明细胞显示大量复制（超过8张）和随之而来的过度表达和独立配体的激活都是沉溺于这种致癌基因和抗MET药物的应答中。在前期设置得到的基本结果，几种特定的多目标的酪氨酸激酶抑制剂和直接针对于MET或者HGF的抗体已经进入了临床试验阶段。在活体和动物模型进行的研究已经表明用TKIs长期治疗会导致机体的治疗耐受性。对MET TKIs的抗性可能是由于一些机制，比如MET基因扩增，过度表达，MET点突变，MET平行路径的激活和KRAS基因的扩增机制。然而，关于对MET的单克隆抗体的再次具有抗性一无所知。
我们以前报道过主要针对细胞外的部分MET的抑制性单克隆抗体的研究进展。它的诱导、再结合、达到MET脱落阈值的能力使其有抑制活性，剩余的跨膜片段通过蛋白酶体降解途径处理掉。因此，DN-30结合到MET后的结果是使其变成可溶性的诱饵MET并且蛋白水解酶会讲解MET激酶。 这促进了MET介导的生物活性的抑制作用。设计了这样一个过程就是因为DN-30的结合使得MET激酶部分活化并且导致抗体介导的受体同源二聚体化和单价Fab片段失去竞争活性的一个过程。
在这个研究中我们表明了不断用MV-DN30来治疗沉瘾癌细胞会使其具有抗性的原因是MET基因的大量复制和MET的过度表达超过了MV-DN30对其有效下调并使其失去活性的的能力。值得注意的是，MV-DN30抗性细胞还会一直对MET TKIs产生耐受性和敏感性。有趣的是，它们获得了药物耐受性，当受到MV-DN30的驱除致死它们的是过多的信号表达。我们还表明对MET TKIs 有抗性的细胞也对MV-DN30敏感，所以，MV-DN30和MET TKIs 对肿瘤细胞的作用是相互促进的。 2.材料与方法 2.1.细胞和试剂
EBC1 细胞从一个患有转移皮肤肿瘤的病人取得，这个患者还患有肺鳞状细胞癌，病例是从日本癌症资料库购买得到。 GTL16 是一种实验室里的克隆胃癌细胞系。HEK-293T细胞系分离于人类胚胎时期的肾，A549细胞系来源于肺癌，都是从ATCC购买来培养的。对MV-DN30有抗性的EBC1细胞可以通过一个逐步的方法培养得到，由Sigma Tau R&D 提供的通过暴露亲代细胞方法来增加抗MET单价单克隆抗体的浓度。亲代细胞用10 mg/ml 的MV-DN30治疗约一个月，直到生成的R10细胞开始产生抗性为止，R10抗性细胞又用逐步增加浓度的MV-DN30治疗。所有的抗体耐受细胞培养在存在MV-DN30并且可以使它们产生耐受性的条件下。大约两个月可以分离到R20抗体抗性细胞，四个月可以分离到R80抗体耐受细胞。EBC1 and GTL16 细胞对MET TKIs PHA-665752 (EBC1 RPHA 50 nM and GTL16 RPHA 150 nM) 都有耐受性，并且向描述的那样培养可以一直保持PHA-665752的存在。该细胞系的遗传身份通过一个短的串珠状重复序列（STR）识别，这段序列在2013年7月再次重复出现。We 我们利用下面的小分子：ATP竞争行MET TKIs PHA-665752 (Tocris Bioscience) and JNJ-38877605 (John-son & Johnson) 和p38MAP激酶抑制剂SB203580 (Merck).2.2.mRNA和基因组DNA的分析
用Trizol 试剂提取得到的RNA被检测到利用多文士病毒的逆转录酶和随机引物合成，cDNA可以用实时的利用电源带动的绿色PCR混合的PCR 技术来实现扩增，根据制造商的说明下面的MET和ACTIN特异性引物要用到： hMET ex 19 Fw: 50-AGTTTACCACCAAGTCAGATGTGT-30; hMET ex 20 Rw: 50-GGGCTCCTCTTGTCATCAGC-3; hACTIN Fw: 50-GGAGGAGCTGGAAGCAGCC-30; hACTIN Rw: 50-GCTGTGCTACGTCGCCCTG-30.根据制造商的说明用实时PCR技术来分析用纯化的DNA基因组迷你试剂盒分析从细胞中提取到的基因组DNA，这种技术是用 TaqMan基因表达的主要结构和TaqMan探针MET基因和RNaseP控制基因的实时定量PCR分析。MET的mRNA的成倍增加和EBC1中MET基因的大量复制以及MV-DN30抗性细胞归一化然后被认可。 2.3.蛋白印迹分析和脉冲追踪代谢标记
蛋白提取液 (40 mg), 细胞上清液(20 ml) 。在细胞裂解前2小时把MET TKI JNJ-38877605加入到指定的地方。 免疫印迹法使用了以下的初级抗体：the anti-MET Intracellular domain (ICD) (zymed, #370100) from Invitrogen, anti-MET ECD (DL21) obtained as described (Prat et al., 1991), anti-phospho-Tyr1234-Tyr 1235MET (#3126), anti-AKT (#9272), anti-phospho-Ser473AKT(#4060),anti-p44/42MAPK(#9102),anti-phospho-Thr202-Tyr204p44/42MAPK#9101),anti-p38MAPK(#8690),anti-phospho-Thr180-Tyr182-p38 MAPK (#9215), from CellSignaling;anti-vinculin (#V9131) from Sigma and anti-b-actin (#I-19 sc-1616) from Santa Cruz Biotechnology.Secondary IgG HRP-Peroxidase antibodies were from Amersham.脉冲追踪实验的1106WT，或MV-DN30抗性的EBC1细胞(R80)都被平铺在60mm的盘里。R80 细胞保存在有或没有抗体（80 mg/ml）存在的条件下，而WT细胞要一直保存在有抗体的条件小16小时。然后，这些细胞在不含L-蛋氨酸但有500mmMCIL-甲硫氨酸S35(脉冲)（易标记）的DMEM培养基中处理20分钟。在这之后，去处放射性标记的培养基，细胞用1ml磷酸盐缓冲液盐水洗两次然后保存在有2mlISCOVE的培养基中，培养基中加入2%FBS，在MV-DN30(80 mg/ml)存在或不存在脉冲3.6和16小时。之后，用免疫沉淀法（IP）在1ml细胞裂解液中进行测定（裂解缓冲液：1% TritonX-100存在下，20 mM Tris-盐酸，5毫米EDTA，10% V / v甘油，150 mM NaCl补充蛋白磷酸酶抑制剂）通过使用抗Met ICD dq13单克隆抗体，而IP法利用抗Met ECD do24单克隆抗体对细胞培养2毫升上清液进行。细胞裂解液和上清液都在有已知抗体的培养基里培养16个小时，抗鼠IgG抗体预包被琼脂糖凝胶蛋白珠形成免疫复合物沉淀下来。免疫沉淀物中的蛋白就会被8% SDS-PAGE 分开，然后转移到3mm的纸上，80度，48小时后蛋白质的放射性就会在投影膜上留下印记。 2.4.生长和可行性分析
用于细胞生长和可行性分析的这些细胞被接种在96孔的培养板上，根据制造商的说明用已知药物在不同时期进行处理然后用细胞滴度发光细胞进行可行性分析。没经过处理的细胞控制在药物载体存在的条件下生长。所有的数据进行归一化到0天的药物治疗。 2.5.荧光细胞分析
对结合在EBC1WT,R20,R80细胞质膜上的MET进行免疫荧光着色，这些细胞要提前在有或没有MV-DN30存在的条件下培养24小时。荧光性的强度可以通过细胞荧光性分析检测到。用于检测的细胞要在PBS中用2%FBS洗涤并且在室温下用抗MET ECD DO24 mAb (100 ng/ml)着色20分钟。然后在室温下细胞又在PBS中用2%FBS洗涤就会逐步产生抗鼠IgG-RPE二抗然后用二脒基苯基吲哚作用20分钟。作为阴性对照，将不含初级抗MET抗体的细胞进行染色。质膜结合的蛋氨酸的荧光强度（AU为单位），通过使用GraphPad Prism软件绘制为箱形绘图图表。
2.6.慢病毒载体转导
EBC1 WT 细胞能稳定地在两种不同量的慢性病毒颗粒编码的MET cDN转导，包括1mg(METþþ)和1.6mg(METþþþ)的p24病毒抗原，其浓度按说明确定。作为对照，WT细胞用含有空载体病毒颗粒感染 。MV-DN30抗性细胞(R20 and R80)只用空载体感染。在感染48小时后接种细胞用于生物化学分析。转导细胞的可行性分析如先前描述的一样进行，让细胞在存在或不存在MV-DN30的条件下上长72小时。如先前所述，MET的蛋白印迹分析和磷酸化的MET蛋白水平和对感染细胞的mRNA的表达水平实时定量PCR分析一样子细胞感染72小时后进行评估。 2.7.药物协同作用分析
在抗MET抗体MV-DN30和MET TKI JNJ-38877605之间进行药物协同作用分析是对WT EBC1和接种在96孔板上的GTL16细胞在用药物治疗72小时后的细胞活力的研究。如果使用一个药品从药物剂量来说要比混合使用的IC50约高10倍左右，双重增加浓度可以用于单药使用和组合使用。评估细胞活力为前面描述的增效作用的药物效应多种分析研究，采用组合指数（CI）和Chou and Talalay 方法。使用相互排他性假设计算CI值（药物作用机理的不同，采用compusyn.exe）软件，可上线的网站：http://compusyn.software.informer.com/，和绘制功能的FA（由这两种药物的组合影响系统分数）。CI值
同一个实验数据用GraphPad Prism软件进行两尾t检验分析至少有三种生物学具有统计学显著意义的结果。P值小于0.05被认为是有意义的。 3.结果
3.1.MV-DN30耐药细胞株的建立
EBC1 肺癌细胞是MET沉瘾细胞，它能放大MET的扩增、过度表达和活化过程。MET TKIs或者MV-DN30对EBC1细胞里的MET具有强烈的破坏它们生存和上长的能力的作用（图A~C）。
我们先前培养的EBC1细胞 对不同的YKIs有抗性表明了这种抗性可能是由于MET基因的进一步扩增。为了产生抗MV-DN30的细胞，我们采用逐步暴露EBC1原代细胞不方法来增加抗体的浓度，并且获得抗不同剂量抗体的细胞系（图1b；约的分步方法详见材料和方法部分）。, 进一步的实验中，我们使用耐20细胞（ebc1 R20）和80（ebc1 R80）毫克/毫升mv-dn30，剂量是分别是前面的约10倍和40倍，然后测这些细胞的抗体IC50（图1a）。在有MV-DN30存在的抗性细胞的生长速度一直和WT细胞差不多（图1C）。
正如前面提到的，MV-DN30发挥它的抑制活性是通过诱导MET的结构域蛋白反正溶蛋白裂解，随后又通过蛋白酶体受体介导受体降解。这种反应减少了细胞表面的MET的大量表达，抑制了MET的活性和受体介导的生物学活性。如图1D所示，事实上，MV-DN30的治疗导致了再EBC1细胞中的MET通过酪氨酸酶的磷酸化消除大量减少。与抗性细胞的生化分析相反的是显示了在相同剂量抗体存在的情况下，MET也会磷酸化并且在质膜上的大量的MET蛋白明显高于保存在相同条件下的WT细胞（图1D,E）。除此，尽管激活的下游目标AKT和MAPK激酶都被保存在有抗体存在的条件下（图1D）。
所有的数据表明，抗EBC1细胞的MV-DN30并不是通过一种足以消除它的结构的活性的方法来下调MET，而是一种允许它的信号转导来调节它的结构磷酸化的方法.3.2.抗性细胞中缺乏MV-DN30抑制活性并不是因为它的活性不足
如图1D,E所示，用MV-DN30处理抗性细胞致使MET大量减少这种减少比处于同等条件下观察的WT细胞中的减少更明显。我们想知道在抗性细胞里的抗体受损是否是由于MET的结构域IPT4发生突变引起，这个结构域是它的集合位点，但是我们没有发现任何突变（数据显示）。
于是，我们评估了是否是抗性细胞中脱落的MET胞外结构域（ECD）对抗体的反应被抑制了。在相同剂量MV-DN30存在的条件下培养了24小时的抗性细胞和WT细胞的上清液中，抗性细胞上清液中含有更丰富的脱落的ECD（图2A）。当对去处抗体24小时后的抗性细胞中MET的表达和活化进行评估时，我们观察到MET总量强烈增加特别是结合在细胞膜上的形式（图2B和图1）。 对抗性细胞再引入MV-DN30细胞会导致上清液中MET ECD含量更高，与在同样剂量处理的WT细胞相比，之后细胞内的MET同时减少了并返回到平时观察的抗性细胞的一半水平（图2 D）。在脉冲代谢标记实验中也观察到了相似的结果：比起WT细胞，抗性细胞合成更多的MET和MV-DN30来促进MET ECD 释放并大量增加（图2E）。 最后， 用更高剂量抗体20 mg/ml (R20)处理EBC1细胞来更好的证明MV-DN30在抗性细胞中是具有活性的。图2F所示在抗性细胞中随着MV-DN30剂量是增加减少了大量MET在细胞膜上的表达（图2A）和磷酸化(图2B)。
总之，所有的结果表明EBC1细胞的抗性不是因为MV-DN30活性缺乏，而是由于用它的饱和能力来促进了一种高效的MET解离。
图1- 抗MV-DN30的EBC1细胞分子表征。 (A) 在有MV-DN30的递增浓度的条件下培养了72小时的EBC1 WT细胞的细胞活力。对未经过处理的细胞(100%) ± s.d.的归一化结果。 (B) 在指定浓度抗体的条件下培养72小时的EBC1 WT细胞或产生MV-DN30抗性的细胞(R10, R20, R40, R80)。与未经过处理的WT细胞(100%) ± s.d归一化结果。 (C) 在MV-DN30(20 and 80 mg/ml)存在的条件下生长的EBC1 WT细胞EBC1R20和R80细胞的生长活性。与未经过处理的WT细胞(100%) ± s.d归一化结果(***P
图2—细胞耐受性并不是由于失去了对MV-DN30的敏感性。(A) 在存在或不存在MV-DN30的环境下培养24小时的EBC1 WTR20和R80细胞的上清液中MET ECD的蛋白印迹。(B)在有或没有（24小时去除）的EBC1WTR20和R80细胞中的蛋白（顶部）和蛋氨酸的酪氨酸磷酸化蛋白印迹。纽蛋白作为控制基础(C)在 EBC1 WT, R20 and R80 细胞中有或没有（24小时去除）MV-DN30的条件下在质膜上结合的MET的荧光强度的箱图。质膜着色如图E。 (D) 在用MV-DN30处理（24h）的EBC1WT R20和R80 细胞中和抗性细胞（图2 D）中观察到的MET总蛋白水平和MET ECD 的蛋白印迹.(E) 在有或没有MV-DN30存在下的EBC1WT和R80细胞里的MET(来源细胞裂解液，上面)和MET ECD（来源与细胞上清液，底部）的用脉冲追踪代谢蛋白标记法的免疫沉淀分析。 (F) 在递增MV-DN30浓度的环境下的EBC1(左图)和R20细胞（右图）的活性检测。未经过处理的WT细胞（左图）或者用20 mg/ml (100%)处理的R20（右图）统计结果(***P
如上图所示（图2BeD），MV-DN30抗性细胞表达MET水平比原代细胞更高。我们怀疑这可能是由于增加的启动子活性或更高的mRNA的可用性，因为你微RNA的负控制微分表达了。在EBC1WT和抗性细胞的荧光素酶检测结果显示排除这些可能性（数据未显示）。
然后我们评估了基因扩增的情况是因为MET大量复制是对激酶抑制剂存在抗性的机制。如图3所示，EBC1抗性细胞显示了MET的大量复制（原代细胞的第24代到30代），这大约是二倍体细胞的15倍。当分析MET的mRNA水平时，我们观察到MET的过度表达是WT细胞的2~3倍，达到了MET正常表达细胞(A549 and HEK-293T)的60~90倍。为了证明这种增加可能是为了维持对MV-DN30的抗性，我们将EBC1WT细胞放在不同量的MET cDNA条件下转导，通过比较EBC1R20和R80细胞mRNA的表达水平来获得（图3）。我们观察到，MET的mRNA以2~3倍的速度剧增，这与在存在MV-DN30的条件下细胞的活性有关（图3D）。除此，尽管有MV-DN30的存在MET保持磷酸化，这就解释了为什么细胞能够存活增加（图3E）。
所有实验结果表明，嗜MET的EBC1细胞变得有抗性是因为MET的进一步扩增和过度表达从而来阻止有效的抗体介导的对MET活性的抑制。图3
3.4.抗MV-DN30的细胞也是嗜MET细胞并有药物依赖性
为了证明抗MV-DN30的细胞也是嗜MET细胞，我们用一种小分子的激酶抑制剂JNJ-38877605来处理细胞。如图4a,b所示，抗MV-DN30的EBC1细胞在有抗体(20 mg/ml for R20 and 80 mg/ml for R80)存在的条件下生长情况显示了当用MET激酶抑制剂JNJ-38877605 (10 nM or 250 nM)处理时，细胞活性的降低和MET磷酸化作用的减弱。和亲代EBC1细胞相比，抗性细胞对JNJ-38877605的敏感剂量更低，可能是由于在抗性细胞中MET的蛋白合成和转运更高效。 从抗性细胞的培养基中去除MV-DN30会导致MET的表达增加（图2B），我们研究了过度表达的生化效应。抗性细胞培养在不存在MV-DN30的条件下，显示了活性下降（图4C）。这些细胞的蛋白印迹分析表明，随着时间的推移逐渐增加了磷酸化（图4D）。然而，24~48h后，after 24e48 h, p38 MAPK的活化清晰可见证明了通常在细胞凋亡反应之前会有一个细胞应激反应。除此之外，在没有MV-DN30存在的条件下培养的抗性细胞中的p38 MAPK会受到一种小分子SB203580 的抑制使得细胞活性得以恢复（图3）。这些数据进一步表明，p38 MAPK信号对于参与药物依赖是至关重要的.重要的是要记住对于嗜MET细胞抗MET酪氨酸激酶抑制剂的药物依赖条件和黑色素瘤有获得性的药物依赖性已经被证明。 为了证明当去除MV-DN30后过多的MET信号使细胞凋亡是正确的，我们用低剂量的MET YKI处理抗性细胞让其充分减少但不会完全抑制MET活性（图4）。事实上，如图4E所示，保存在不含MV-DN30并用 10 nM JNJ-38877605（低于IC50浓度）处理的抗性细胞可以恢复它们的活性，并且这种水平类似于保存在有抗体存在的培养条件下的抗性细胞的活性水平。
总之，这些结果表明，MV-DN30抗性细胞都是嗜MET细胞并且它们的繁殖和生存都有药物依赖性。图4
3.5.在嗜MET细胞中MV-DN30和MET TKIs的协同作用
MET-TKIs 和 MV-DN30 都可以有效的抑制EBC1细胞的活性，我们想知道这两种抗MET化合物是否表现增强或协同作用。单独或在有非常低剂量的MV-DN30存在的条件下（0.15~2.5毫克/毫升，从10倍以下的IC50开始），我们用逐步增加MET抑制剂JNJ-38877605的方法来处理EBC1 WT细胞。然后我们分析细胞活力和对药物治疗的两种药物的组合效应的性质，利用多药效果分析。如图5C所示，联合治疗导致的剂量尽可能低为1.25~20 nm jnj-38877605在0.15~2.5毫克/毫升mv-dn30存在活性降低。当在GTL16 WT 胃癌细胞上做这个实验室会得到相似的结果（图5D）。如图5A、B所示，多药效应分析表明了 EBC1 and GTL16 WT细胞的CI值都小于1，从而表明了JNJ-38877605和 MV-DN30之间有药物协同作用.所有的这些数据表明用MET TKI和MV-DN30联合治疗可以有效地减少嗜MET细胞的活性，剂量明显低于单独一种药物治疗的药量。图5
4.讨论
临床效应甚至是最有效的靶向治疗都被发展的耐药性所限制。显而易见，这种耐药性机制已经被广泛研究。从癌细胞和抗酪氨酸激酶抑制剂表明，获得性耐药的最常见的机制包括在药物目标本身的二次突变的患者获得的数据，激活下游信号转导或平行的信号转导通路的激活突变。 即使对关于癌症是怎样产生耐药性抗体的了解很少，一些现象提示用抗EGFR 和抗HER2抗体治疗的病人体内有耐药机制的建立。在EGER中的二次突变表明了免疫调节药物与EGFR的结合受到破坏从而调节了抵抗力。除此之外，最近的研究还证明了EGFR或HER2的信号转导通路的激活可以分别绕过西妥昔单抗或曲妥单抗的抑制；这些包括EGFR配体水平增加，MET RTK的扩增或过度表达，下游或平行激活信号转导途径。
在癌症治疗中MET受体已经变成了最具关注的目标，因为很多研究表明，MET在多种人类肿瘤中具有组成性活性。它的失调可能是由于不同的机制包括过度表达，基因扩增，激活突变和受体介导的刺激自分泌或旁分泌的增加。生殖细胞的激活突变的识别和遗传型肾乳头状癌直接证明了MET和人类肿瘤发生有关的概念。MET的酪氨酸激酶的结构域中激活突变位点已经在散发肿瘤中确定。然而，在人类癌症中变化频繁的是转录表达的过程，这个过程是由原癌基因激活诱导抑癌基因失活和对特定的为mRNA或缺氧刺激的下调过程。在原发性肿瘤中由基因扩增引起的MET过度表达是少见的，但在肺癌和结肠癌中变得抗靶向其它RTKs治疗的情况更频繁。临床证据表明癌细胞是沉溺在原癌基因中的细胞，在这种细胞中的MET具有组织性活性并且它们的抑制结果就是使其致瘤性被破坏。然而，用小剂量的激酶抑制剂延长对嗜MET细胞的处理会导致二倍抗性的出现，这种机制可以被维持比如MET扩增或突变,KRAS的扩增或EGFR家族成员的活化。 在我们的研究中表明,在嗜MET细胞中对MET特定抗体MV-DN30的抗性获得是由于MET复制数量的大量增加。这一现象的机理解释依赖于染色体外的MET复制的动态调节，造成了一种癌症对治疗的适应性程序。MET上调的增加是由于MET基因扩增造成的这种现象并不明显当抗性细胞培养在有抗体（这种抗体介导了MET的下调）存在的条件下，但是在没有这种抗体存在的条件却是很明显清晰的。我们观察到蛋白的增加平行下来是METmRNA增加的2~3倍。EBC1 原代细胞的METcDNA的转导可以达到一个和抗性细胞一样是表达水平，证明了事实上细胞表达更多的MET可以减少对MV-DN30抑制活性的敏感性。WT EBC1细胞和大多数嗜MET细胞一样可以表达比正常表达细胞的约30倍多的MET；因此，在抗性细胞中2~3倍的增加可以引起MET水平比那些正常细胞中的MET水平高60~90倍。在缺氧的环境下观察A549细胞中MET呈3倍增加才能满足它的生化效应，在抗MV-DN30的EBC1细胞中MET增加可以解释为什么抗体能够有效地下调MET。除此，作为抗性细胞识别增加的脱落的MET导致了MET ECD在细胞内的累积，并且脱落的ECD可以和细胞膜上的MV-DND30结合位点结合从而减少抗体的抑制效应。 抗性细胞仍然依赖于MEI的信号传导来增殖和生存，MET可以完全被TKIR抑制从而导致它们的增殖受到抑制。有趣的是，当MET变得非常活跃的时候，可以通过增加在MV-DN30存在下的MET 的表达在这种适宜的有利的环境下来使其对药物的去除效果减弱。我们的结果和报告是一致的都表明了，正常细胞和肿瘤细胞不仅对信号（即该通路被激活的信号）的质量敏感而且对数量也很敏感（这种量就是怎样激活通路）。信号过量可导致细胞应激（在我们的情况下，通过p38 MAPK活化）导致细胞死亡。事实上，在抗体缺乏，低剂量的遇到了TKI治疗耐药细胞（抑制野生型细胞活力）增加了他们的活力，减少了信号的水平细胞持续强度的可能。 Das Thakur做了一个类似的观察，这个人证明了人类黑色素瘤移植提供的抗药性，药物的去除使耐药肿瘤的肿瘤消退是由于依赖BRAT信号过量。有趣的是，他还表明不连续的药物剂量，运用耐药细胞在没有药物环境下的劣势来防止耐药性的发作。这在嗜MET细胞中也被证明是正确的，无论是抗MV-DN30还是抗TKIs的EBC1细胞都表现出药物依赖性并且去除药物会致死细胞。因此，可以想象，为了防止由于癌基因过量用药而产生抗性，间断性用药的机制可能会比连续用药更有效。
此外，我们表明，抗体治疗是活跃的细胞提供的抗酪氨酸激酶抑制剂，相反，TKI治疗耐mv-dn30细胞有效 。这并不奇怪，因为这两种类型的抗性细胞都是嗜MET细胞，因此，依赖MET的信号减少导致了它们的死亡。这种发现在临床上受到关注，因为它表明了用抗MET的抗体治疗病人可能是没用的，病人的对TKIs的抗性是由于MET表达的增加或者是它们的毒性限制了TKI的剂量。 另一个处于我们的观察的结果是MV-DN30和MET-TKIs之间的协同作用。值得注意的是，尽管是几个实验，在用MET TKI和MV-DN30治疗时我们并没能过培养出抗性细胞。这些观察的临床意义提出了一点就是两种药物剂量的减少的可能性，结果它们又不利影响当需要保持治疗效应时有可能会降低或延迟。 总的来说，在事实的角度评估我们的结果就是它们表明了两种可能会克服或防止对METmAbs抗性的治疗策略: (i)一种就是用抗MET的mAb加上MET TKI的联合治疗 (ii) 利用抗性细胞的药物依赖性的定期间断性的节律治疗。
