利用ELISA法检测Bt转基因在野生近缘种中表达的技术报告
（复旦大学）
1.技术背景介绍（包括技术的新颖性或对现有技术的改进、共性、用途、技术流程以及关键技术细节上的特别处）
外源转基因逃逸后在野生近缘种中的正常表达，是其能够进一步导致生态风险的前提和基础。如果转基因逃逸到野生近缘种群体之后能够正常表达，可能会改变野生近缘种的生态适合度，改变含转基因个体生存竞争能力，从而导致一定的生态后果。同时，转基因在野生近缘种遗传背景中的是否具有正常功能，是转基因能否在群体中传递、积累和扩散的关键。因此，转基因一旦从作物中逃逸至其野生近缘种，就应该对转基因的表达水平进行研究，以便预测该转基因是否能够导致适合度的变化，进而带来生态风险。此外，外源转基因在野生近缘种中的表达量和表达部位可能和在栽培物种中的不同，因此需要对植株的不同组织的表达水平分别进行检测。
本技术报告拟通过对Bt基因表达产物Cry1A（c）蛋白酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent aay, ELISA）检测的流程描述，规范ELISA检测 Bt蛋白表达的技术平台，并回答转基因能否在野生种群中表达；转基因在不同组织中的表达量与作物相比是否相同；转基因的表达在野生杂种各世代间会有怎样的变化等问题，并以此进一步推测转基因逃逸到野生近缘种之后的表现以及可能带来的生态风险。
2.ELISA法检测原理（）
Bt转基因的表达产物为Cry1A（c），它是一种非广普性的抗虫蛋白，能在栽培稻植株组织中的正常表达，会给个体带来抗虫的适合度性状。ELISA检测法具有灵敏度高、重复性好、定量精确等特点，它的关键是需要制备针对靶标蛋白的抗体。Cry1A（c）蛋白是一种大分子蛋白，相对比较容易制备该检测所需的抗体。因此，目前针对Bt基因表达的研究，多采用ELISA方法进行。
本报告以Bt CryA（c）为例，描述了双抗夹心式的ELISA（sandwich ELISA）检测法。双抗夹心法是ELISA法中最稳定和可靠的一种定量检测方式。它利用两个不同来源的Cry1A（c）蛋白特异性抗体（单克隆抗体尤佳）：其一包被在固相载体，另一与具有特定显色反应的碱性磷酸酶（AP）联接（酶标抗体）。
进行检测的步骤如下：（1）样本中的靶标Cry1A（c）蛋白因免疫反应吸附于固相载体；（2）加入酶标抗体，通过与固相载体上样本Cry1A（c）蛋白的免疫反应发生吸附；（3）加入AP酶的底物进行显色反应；（4）通过标准曲线确定Cry1A（c）的表达量。
为更好地对该技术进行描述，本报告以Bt转基因栽培稻纯系Ms67和Ba23为例（Bt基因在Ms67和Ba23中表达稳定，且具备抗虫的效应）来说明关键技术的流程。实验以Bt基因在亲本栽培稻中的表达量为参照，研究Bt转基因在栽培稻×野生稻的杂种F1和F2代（或更高世代）中的表达水平，包括不同世代之间的（亲本-F1代-F2代）比较以及同一世代不同杂交组合之间的比较，以此来探索转基因在野生稻中的表达规律。
3.技术需要的材料与设备
3.1 实验材料
3.1.1 Bt抗虫转基因水稻亲本：Ms6
7、Ba23，作为转基因能正常表达的参照。
3.1.2通过人工杂交获得转基因稻×野生稻（不同来源的W1，W2）的杂交F1代及其自交产生的F2代。F1代包括：Ms67×W1, Ms67×W2, Ba23×W1, Ba23×W2；F2代材料包括：F2- Ms67×W1，F2- Ms67×W2，F2- Ba23×W1，F2- Ba23×W2。
3.1.3非转基因亲本对照：选取Ms67和Ba23的非转基因亲本Minghui-86作为ELISA反应中的阴性对照。
各种材料在正式进行ELISA检测前，需先进行转基因特异性的分子鉴定，确定为正确的实验材料。
3.2种植条件：
常规水稻用地及田间管理。
3.3主要仪器和设备：
ELISA反应用仪器：紫外分光仪、酶标仪、恒温生物培养箱、低温离心机。 种子萌发及培养设备：55摄氏度烘箱、光照培养箱、平底托盘或培养皿。 实验室常规仪器及耗材：中性滤纸，微量移液枪、研钵等。
4.技术流程
4.1 种子萌发
萌发转基因栽培稻（Ms6
7、Ba23）、非转基因亲本对照（Minghui-86）、栽培稻×野生稻杂种F1代、及其自交产生的F2代种子。种子萌发前需在55℃烘烤5～7天以打破种子的休眠性。
4.2 材料的分子鉴定和选取
种子萌发至幼苗三叶期后，采集叶片提取DNA，用Bt基因特异性引物进行DNA扩增和分子鉴定，确定各实验材料的准确性，尤其需要确认所选择的F2分离后代的植株中确实含有抗虫转基因。
4.2 田间种植
选取生长良好的植株按照合理田间设计方案（可视具体的实验目的而定）移栽至栽培稻田中。为消除环境对转基因表达的影响和保证样本量，实验中的每一个处理都要设三次以上重复，以便进行统计分析。
4.3样本采集
根据实验目的可以在植株的不同生长时期（如：分蘖期、拔节期、花期、成熟期等）采集不同组织（如：根、叶片、茎干）的样本进行检测。每次采样时尽量使样本量保持一致。
4.4 ELISA法检测Bt蛋白表达量
4.4.1 利用考马斯亮蓝法测定样本中的总可溶性蛋白。
4.4.2 采用标准的双抗夹心ELISA法，检测样本中Bt蛋白的含量。
4.4.3 Bt基因的表达的计算方式：
Bt基因表达水平=样本Bt蛋白的含量 / 总可溶性蛋白含量 × ％。
4.5 比较与分析
4.5.1 以Bt转基因在栽培稻中的表达量为基准，比较栽培稻×野生稻杂交F1代、及F2代各时期、各组织中Bt转基因的表达量，分析转基因在野生近缘种中的表达水平。
4.5.2 对Bt转基因的表达量在不同栽培稻×野生稻杂交组合之间进行比较，分析抗虫转基因在不同遗传背景的野生近缘种中的表达水平。
4.6 技术检测结果汇报
汇报应包括以下内容：
4.6.1 试验名称、目的和原理；试验的起止日期；实验室名称及地址；
4.6.2 受试植物的名称、来源、外源基因及其表达蛋白质的量和性质，实验的设备、仪器和试剂药品；
4.6.3 实验材料：学名及品系、来源及种植条件等；
4.6.4 实验方法：实验设计的原理和具体的实验方法、操作；
4.6.5 结果：将每个阶段、每个处理的表达量与相应的亲本表达量进行统计分析，并对所得结果进行科学的解释，并对转基因逃逸到野生近缘种的生态风险进行预测。
5.实验过程中的质量控制
在进行ELISA检测时，严格按照生理学实验的方法，保证实验条件的一致性和可比性，加强实验操作的规范性和精确性。
6.主要参考文献
略。
