常规标本制作程序
第一节
组织标本收集取材固定 一， 标本收集和查验程序。
对于所有送检的标本，必须认真执行查验程序，方能进入下一程序，其主要程序是：
1， 收集标本时：要仔细查对申请单上的姓名与标本上的姓名，序号是否一致；标本的件数与申请单是否相符；标本是否用固定液固定过。
2， 标本经上述验收后，进行编号登记，以防错乱。编号按年份和流水号两种方法，如果为了今后的查找较为方便，按年份编号为较好。
二， 活检组织取材：在外科送检的诸多材料中，对于每一例病例的材料，大小都不一样，但对于较大的标本，不可能都对其进行制作切片，因此，选择适合于病理技术制作，适合于病理诊断且有利于回顾性研究等各方面的材料，是病理活检的关键，通常把这过程称为取材。
（一）取材时必须注意以下问题：
①
取出所有送检的标本，量其大小，称其重量，描写其色泽，质地，形状和肉眼所见表面情况。当标本切开后，应详细描写其切面的颜色，硬度，病变部位等，必要时绘图说明。
②
对于细小标本如肺支气管穿刺物标本胃肠镜活检标本
[1]等，应将其染上伊红颜色后，用擦镜纸或特别脱水袋将其包上或装上，以防漏出脱水盒的小孔。
③
对于有传染性的标本，让标本彻底固定后再取材。如结核瘤标本等。
④
对于罕见特殊的标本，应小心保存好，在不影响诊断的情况下，尽量保存好大体标本。以利于教学标本，陈列标本的收集。
⑤
边取材边固定，组织标本较多的单位，取材经常要花上几个小时，如果从下午2：30开始取材，至5：30完成，那么先取的材料就可以多固定几个小时，如此可以防止固定时间不足，同时也可防止组织发生自溶。
⑥
对于骨髓穿刺的组织，可先用10%硝酸浸泡30分钟左右，然后再与其它组织进行处理。
⑦
骨组织和钙化组织，应彻底脱钙后，方能进行制作。具体用大头针能顺利扎入骨组织则可。
⑧
活检组织取材，不能太厚，以不超过2mm为宜。以防脱水不彻底，不利于制片。
⑨
每取完一例标本后，所有的工具如刀，剪，盘镊，切板等，必须用水冲洗干净，以免污染，混淆于其它病例。 ⑩
组织取完即刻放入打印好号码的盒内，放入固定液中固定。
（二）
各种器官及其肿瘤取材的方法
1、乳腺：
纤维腺瘤：肉眼观察其形状、体积、包膜是否完整，切面是否均匀，有无坏死，取材：肿瘤连包膜1-3块（即周边组织1块，包膜与周边组织1块，如果肿瘤不大，上述几种即周边包膜和肿瘤可取1块）。
乳腺癌：体积，皮肤颜色，有无水肿或变硬，肿大淋巴结，数量，组别，硬度，及切面情况。沿乳腺的最长径经过乳头切开，观察肿瘤的面积，颜色，硬度及浸润情况等。取材：乳头及其下组织，肿瘤及肿瘤交界处，肿瘤下胸肌，全部淋巴结（注明组别），根据各种病变的情况，确定取材的块数，如切缘、包膜、肿瘤等均应取到各组淋巴结分别全部切材。
2、食管癌：
切除的食管长度及周径，管壁有无水肿或粘连，肿大淋巴结的位置，大小，硬度及数目。沿肿瘤对侧纵形切开，肿瘤大小及形状。取材：肿瘤上下交界处各取一块。或沿长轴通过肿瘤全径取出大切片或分成数段，全部淋巴结，分别切块包埋
3、胃溃疡及胃癌：
全胃或部分切除，大弯及小弯长度，肿大淋巴结的部位、大小，硬度及数目，病变处相应浆膜面有何变化。一般沿大弯剪开，观察病变大小，深度，边缘及周围变化，如为癌瘤，属何种类型，与大小切端的距离。取材：病变及与其交界处胃壁全层的胃组织（尽量侧重于小弯，并注意沿长轴切取组织块），上下切端组织，肿大的淋巴结（注明组别）
4、阑尾：一般于近、中、远三段各取一组织块，远端一块尽量靠近尖端，以免遗漏尖癌。已被剖开者，沿纵轴取组织块，如检查时不能发现病变所在，需多做断面，以寻觅病变部位和取组织块。
5、肠癌：切除肠管的长度，肿瘤 生长部位、大小、局部浆膜等情况。如为十二指肠癌，则应注意与特氏壶腹的关系。取材：肿瘤 及交界处肠壁全层组织，上下切端，肿大的淋巴结。
6、肠梗阻：梗阻部位、长度、直径及表面变化（颜色、水肿、充血、出血）；检查肠系膜 的变化，沿病变血管解剖，作多数横断面，观察血管壁是否变厚，寻找栓塞的起止部位；肠粘膜有无溃疡。取材：病变最显著处及肠的两端各切一块，病变血管（带些系膜）各切一块。
7、肠套叠：注意套叠部位及套叠 关系，寻找阑尾，肠壁是否增厚及变硬，以手指放入小肠为引导，沿肠系膜 剪开，寻找有无原发病变（在套入部位的最前端寻找有无肿瘤、溃疡等到变化）。切面观察各层肠壁的厚度、水肿、充血、出血、坏死及硬变等到情况。取材：原发病变（如肿块，溃疡等）。有变化的肠壁厚度，阑尾，肿大淋巴结。
8、肠结核：外部有无粘连，白色斑块、结节、狭窄，病变上下的肠段有何改变，有无淋巴结肿大。沿病变对侧切开，观察病变情况（溃疡、突起、体积、有无息肉样改变，肠道是否变为狭窄或增厚）。取材：病变部，上下切缘，肿大的淋巴结。
9、肝活体组织：大小、形状、颜色、表面及切面有无结节状或纤
维组织增生，有无灰白色结节等。取材：包含各病变的组织，如标本较小，全部切取。
10、阴茎癌：肿瘤生长的部位，大小，溃烂及向阴茎浸润情况，切端与肿瘤明显浸润处的距离。纵切（通过尿管）观察切面情况。取材：肿瘤切面一块，阴茎截除端一块。
11、肾结核：注入福尔马林固定一周再切，体积，表面是否光滑，有无粘连、灰白色小结节，输尿管长度，直径，及硬度。沿输尿管及肾盂切开，肾盂是否扩张，切面破坏情况，粘膜变化，主质变化，乳头情况，（注明哪一个）；输尿管厚度，有否梗塞，粘膜情况。取材：肾主质包括病变及交界处，输尿管及切端。
12、肾盂积水：先抽去积液，再注入固定液后再检查。肾体积、表面性状（色泽、平滑否、结节、粘连）。沿肾、肾盂及输尿管切开，注意阻塞部位及原因。观察肾盏、肾盂及输尿管扩张情况，肾实质厚度。取材：肾实质厚处及薄处各取一块，输尿管各取一块。
13、肾癌：肾及肿瘤之体积及重量，肿瘤部位及与肾的关系，表面有无水肿或粘连，有无肿大淋巴结。切面：肿瘤位置、形状、大小、颜色、包膜、坏死、出血、囊性变，肾盂与输尿管中有无蔓延。取材：肿瘤包括其旁的正常组织，肿瘤 以外的肾组织、输尿管。
14、膀胱癌：全部或部代分膀胱切除，除非癌瘤位于前侧，一般沿前侧切开，肿瘤位置，与输尿管中及膀胱的关系、体积、生长
情况及浸润情况，有无淋巴结（大小，硬度，切面变化）。取材：沿纵轴方向取材。肿瘤及膀胱壁全层组织；乳头状瘤应包括蒂部组织，三角区组织。
15、前列腺：形态，体积，颜色，硬度，包膜情况。切面：颜色，质均匀否，有无坏死，出血，囊性变。作多个与尿道垂直的平行切面观察。取材：颜色均匀处取一块，不均匀时在发黄处尽量多切，包含尿道。
16、肺叶或肺段：先自支气管注入福尔马林固定。检察前应观察X线片。病变与支气管有关者，沿支气管切开；病变不沿支气管者，可作书页状切开：
① 肺癌：位置在支气管哪一支，距切端多远，大小，形状，质地是否均匀，有无坏死、空洞、边缘有无纤维组织围绕或不规则浸润，是否压迫支气管干，肺门淋巴结情况。取材：癌组织，癌与正常组织的交界处，支气管断端，肺门或局部淋巴结。
② 支气管扩张：新鲜时剪开，系囊形或圆柱形（管形）扩张，属哪级支气管，扩张的支气管之直径，或宽度，管壁厚度，颜色周围组织有何变化，粘膜光滑或呈皱纹，管腔有无脓液，是否穿破形成肺脓肿。取材：扩张的支气管，支气管周围发炎组织，脓肿壁。
③ 肺脓肿：部位、直径、单腔或多腔，其中脓液性质及气味，有无悬梁状血管，腔壁光滑度，厚度，是否与支气管相通，
有无散布的小脓肿，有无支气管扩张，支气管中有无异物，脓肿内有无硫磺样颗粒。取材：脓肿壁，与脓肿有关的支气管，肺组织。
④ 肺结核空洞：部位，直径，单腔或多腔，腔中有无脓液、干革命酷样坏死、悬梁状血管，空洞壁厚度，及硬度，腔内为肉芽或纤维组织，寻找与支气管连通的瘘管及所散播的病变，肺门淋巴结情况。取材：空洞壁，散播的病变，肺门淋巴结。
⑤ 肺囊肿：数目，部位，直径，囊肿壁光滑度及厚度，与支气管的关系，收集囊内液体检查其性状。取材：囊肿壁及其旁肺组织，如为包虫病，则应在包虫囊的液体中寻找子囊及幼虫头节（离心后）。
17、脾脏：重量，大小、颜色，表面有否粘连，然后沿脾长轴作多个平行切开，在切面上看包膜及脾髓情况。
① 淤血性脾肿大或脾功能亢进，注意静脉内有无血栓，静脉壁有无变化，有无梗死，切面上有无含铁小结节。 ② 脾破裂：注意踊裂部位，长度，有无血凝块充填破裂口。 取材：带有包膜的脾组织，脾中心组织，脾门附近包括较大的血管，如有副脾，淋巴结各一块，脾破裂应包括裂吕充物。
18、淋巴结：大小，形状，包膜情况，成群者注意相互间粘连情况，切面的颜色，均匀度，质地，包膜，等情况。取材：整个短轴切面，互相粘连者包括粘连部位。
19、骨肿瘤：检查前先看其X片。有皮肤软组织者将与肿瘤无关部剔除，然后锯开，有条件者，可与锯开前摄X线片以作比较。
检查肿瘤体积及形状，切面颜色，硬度，出血，坏死，囊变，何处为原发，与骨膜 ，骨皮质及骨髓之间关系，有无破坏情况，有无包膜，其厚度及硬度，无包膜者注意其对软组织浸润情况。取材：肿瘤及与组织交界处，骨破坏处，软组织浸润处。 20、甲状腺：重量，大小，形状，有无结节，寻找背面有无甲状旁腺，切面质地是否均匀，含胶质状况，有无结节，出血，坏死，钙化，囊变等，有无细小灰白色疤痕样病变。 甲状腺腺瘤与腺癌：肿瘤部位， 大小， 包膜完整否，切面质地，有无出血，坏死，钙化，囊性变及其内容物，有无乳头或绒毛状改变，肿瘤以外组织有无灰白色小节。
取材：最大面积，切成数块全作切片，如为根治术，要取全部淋巴结。
21、刮宫或阴道排出物标志：疑有妊娠者，须仔细寻找有无胎盘绒毛，眼观不能判断时，须取组织块，尤应注意检查血凝块。
22、子宫标本：除按要求检查病变外，如须研究宫颈癌，可与子宫颈12点，3点，6点，9点处取宫颈及宫颈内膜交界处组织，必要时取其他各点组织。
23、卵巢肿瘤：形状大小，较大者应称其重量，表面色泽，光滑度，与输卵管的关系，有无粘连，囊性者自膨大部远端剪开，
查囊与输卵管腔是否相通，单房或多房，内壁光滑度，有无质或乳头状生长区，乳头脆性，囊内容物性质。实性肿瘤切面色泽、硬度，有无出血，坏死，变性等。
取材：囊性瘤取囊壁较厚处，实质，突起处，囊与输卵管相连处及输卵管。实性瘤取边缘及中央不同结构组织及输卵管。
24、胎盘：形状，大小，重量，母体面绒毛有无缺损、出血、钙化、变性坏死，及其范围大小，羊膜和血管情况，脐带长度，直径，有无扭转打结、血管栓塞等。 取材：母体面、子体面脐带各一块。
25、瘘管或窦道组织：应作多数横断面检查，适当取材。
26、眼球标本：标本固定后，先经缓慢脱水至今95%酒精，然后切开，除病变部位特殊取材外，一般取水平切面，通过视神经和瞳孔。要求保存眼球队的完整性，如结膜、视神经、黄斑及晶状体等，都应完整无缺，切时刀刃锐利，以免人为地损坏眼球结构。若须行火棉胶切片，而本单位无条件时，可送到有关单位检查。
27、软组织肿瘤标本：部位、大小、形状、色泽、表面有无包膜，完整否，硬度，切面有无出血、坏死、囊性变等，与周围组织的关系，切面暴露最大面，必要时多作几个平行切面。 取材：肿瘤，周围组织，切端组织。
28、其它标本：依上述原则检查及取材，如标本有特殊情况，
则依其特点处理。[2] 第三节
常规病理标本的制作程序
常规组织固定
在组织病理学中，不管是组织切片乃至电镜还是大体标本的保存，都必须进行及时的适当的和有效的固定。组织只有经过固定，才能完成随后的一系列的制作，直至切片的最后完成。每个医务工作人员都能容易地把组织固定起来，但是，要清楚了解固定的过程及其定义是一件十分不易的事，下面我们将逐一解答如下。
（一）、固定的作用
组织经一系列的处理后，就必须进行固定，当然有的组织是先固定，再进行处理，然后再固定。固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。
（二）固定的目的
1、能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组织。固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都 由蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，
细菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？除了细菌参与外，其本身也是很重要的。因为组织离体后，供应这此组织的血液随之消失，细胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构受到破坏，破坏后释放出溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。
2、保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖元等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。细胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。这些物质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体，很容易受到破坏，因此应特别小心。
3、使组织硬化，便于切块。刚离体的组织，除了胃组织以外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均，粘膜和肌层很容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就必须将组织彻底固定，再行取材。
4、对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。病理标本、种类繁多，成份复杂，各种病例都有，具有传染性的病种也不少，如结核、肝炎、麻风、性病等等。对于此类标本，应进行彻底的固定后，再行取材，如结核球，固定时间应在3-5天。
5、保存好大体标本。对于有教学任务的医院病理科，除搞好疾病的
诊断外，还有收集有价值的大体标本，有些大体标本，是很难得到的。因此要求在平时就要留心观察，小心处理。遇到有教学价值的罕见的典型的标本，就必须及时固定，认真给予对待。
6、可增强染色的作用。组织经过及时的固定，最终可见到切片有鲜艳的染色，而些时如果有一批未经及时固定的组织，将看到最终的结果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得结论，固定可以增强染色的作用。
（三）固定的注意事项
1、组织固定越新鲜越好。组织一经离体，就能及时地固定，这是最好的。根据实验，如果要获得某些酶的染色，固定最好在组织离体后30秒至1分钟。对于其它达不到些要求是越快越好。
2、组织固定，组织块不宜过大。凡是需要固定的组织，都不应该太大太厚，这是因为所有的固定液穿透力不够强，浸透度不够快的缘故。如果较大厚的组织，不经处理就进行固定，那么待固定液进入至中间对可能这些组织早就发生自溶了。因此，对于较大的组织，必须先进行处理，切成制片材料再行固定，这是最佳的处理方法，如遇到胃肠的器官，则应将其剪开，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因这类组织、粘膜和肌层容易分开，没固定时，难以取得最佳制片材料，对于产酶类的器官如肝、肾、脾等，更要处理好，否则更容易出现自溶现象。
3、对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。有的固定液对于组织有膨胀作用。固定剂是一种化学试剂，有液体和固体之分，一
般使用较多的是液体，而固体固定剂如多聚甲醛，则多用于实验研究的组织固定。固定剂的种类繁多，成份复杂，对组织的作用不尽相同，英国著名的组织化学专家Pearse指出：对于每个既定的组织化学方法来说，选择最合适的方法是极为重要：在组织化学研究准备阶段不论采用什么固定剂，都必须尽可能确切地知道它们对于各种组织成分的反应基团的效用。Jones（1973），指出理想的固定剂必须具备的条件是，防止渗透损伤和妆缩，以达到在各级可见度的水平皆无形态变化；要求组织所有的成分能保留于原位。他认为有三种试剂即甲醛、戊二醛和丙稀醛接近于达到上述要求。[4] 为了更好地把组织中各种成分尽量保存好，尽量好给予显示出来，就决不能千篇1律地使用一种固定液，而必须认真地深入研究各种固定液的性能和使用方法。例如：丙酮，它对组织有明显的皱缩，硬化作用，平常它是决不会被用来作固定液的，用它不但太浪费，造价太高，而且也使切片较为困难，但是，对于某些酶的研究，狂犬病脑组织的固定，某些细胞的培养等。最好的固定液还是丙酮。因为如果使用福尔马林固定液、石蜡切片显示酸碱磷酸酶就显示不好，狂犬病病毒的包函体就会消失掉，又如醋酸，它对胶原纤维等有膨胀的作用。由于各种固定液对不同的组织有不同的作用，因此许多专家将根据各种固定液的优缺点，配制出许多混合液的方法来，给组织的良好固定起到了非常积极的作用。但是，值得指出的是并非所有的固定液都不是十全十美的，例如，酒精、甲醛、醋酸固定液，对组织固定很好，
组织中各物质的染色也十分清晰，但对固定脱水盒为铜质的组织时，效果就不好，原因是醋酸跟酮可发生反应，产生醋酸铜，沉淀于组织中，可造成对抗原的损害，对于免疫组织化学的显示，经实验证明：可呈弱阳性乃至阴性。由此可见，固定液的选择正确与否决定着对某些病例的免疫组化标记的成败关键。在我们的日常工作科研中，对于组织的固定，应有针对性的选择，方能获得满意的效果。
4、组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。时间太短，就不能很多的固定组织，因为不管组织大小，固定液浸入组织之中，都需要有一定的时间，时间太短，就会影响组织固定的效果，对以后一系列关系的处理都有影响，切片质量难以保证，固定时间太长，也不好。组织长时间的固定，福尔马林会产生一种酸，影响核的染色。对于固定很长时间的陈列性标本制片后切片染色不鲜艳，显得非常陈旧。另外，长时间的固定往往会出现福尔马林色素，尤其是造血器官的标本，更应注意。固定时间过长，可降低抗原的活性。
5、固定液的量要充分。固定液量的足够与否决定着组织固定的成败，有的人认为，固定液的量与组织的比应是20：1，这个要求对于小组织来说是完全可以达到的，但对于大标本来说，则是一件非常困难的事情。因为对于大医院来说，每天都有几十上百例的标本，小如大头针大小，大的达几十斤的肿瘤，对于这样大的标本，按20：1的比例来做，显然是不可能的事，既要做到组织
能固定好，又不使组织吹干就必须具体情况具体处理。对于大的标本，原则上是不让其暴露部分被吹干，这是因为在现实111当中，大的标本往往露出容器一大半，因此对于这种情况，应取些脱脂棉或纱布，浸湿固定液后，盖于组织表面，以免使组织被风干，影响制片效果。
6、特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。一般的病例标本，如没特殊的要求，都可以应用甲醛配成的各种固定液来固定。但是，如果要显示狂犬病毒的包含体时，应用上述的的固定液就不行了，必须采用丙酮来固定，显示糖元，可选择无水酒精或丙酮来固定组织。固定剂是一种化学语试剂，有液体和固体及之分，平常使用的多为液体，Pearse指出，对每个既定的组织化学方法来说，选用最合适的固定方法是极为重要的；在组织化学研究中的准备阶段，不论采用什么固定剂，都必须尽可能确切地知道它们对于各种组织成分反应基团的效用。
7、组织的第二次固定或后固定。在一般的常规病理活检组织中，往往用一种固定液，就能够达到目的，获得满意的结果。但是，对于某些特殊病例光用一种固定液是不够的，必须根据不同的情况，使用特殊的固定液再次将组织固定，或者在切片后染色前再行固定。这种方法称为二次固定或后固定。例如：胚胎性横纹肌肉瘤，由于肿瘤细胞发育较幼稚，完全不象成熟的横纹肌组织所固有的横纹，在进行特殊染色前，就必须用Zenker氏固定液进行第二次固定，方能较好地显示出横纹肌纤维来。否则，效果不佳。
另外，电镜固定的标本，通常都需要后固定。其使用方法是先用戊二醛固定，再用奥酸固定。
（四）固定液的使用
当前，应用于固定试剂的种类较多，它们对于固定不同的组织成分起着不同的作用，因此我们在使用时应该了解不同固定剂的效能，才能合理的固定组织。根据Bencroft的分类法，将不同的固定剂分为四种类型：
Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。
Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。 Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。 Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。[5]
上述四种类型的固定剂，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到。下面根据使用的需要，将着重介绍几种常用的固定剂。
（十）甲醛
甲醛商品名为福尔马林，一般市售的含甲醛37—40%，由甲醛气体饱和于水而成，比重为1.12。它也可以稳定的固体形式存在，它的成分为高分子量的聚合体，称为多聚甲醛。
甲醛溶液较难纯化，在每批市售商品中，都含有不少的杂质如甲醇，这种在组织化学方法当中，能使酶钝化，影响其反应。甲酸，它可使固定液变酸，在陈列标本或长时间固定的组织，由于酸的作用，
往往细胞核染色欠佳。
甲醛有效固定作用的要点是，在蛋白质末端基团之间形成交联链。参与甲醛固定蛋白质的基团，主要为氨基，亚氨基及酰氨基，肽，胍基，羟基，SH和芳香环。甲醛与组织蛋白类的反应是多样和复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键。甲醛有这种交联的功能，也是它的缺点，在用甲醛固定过的组织中，需要做免疫组化的，往往提倡用酶消化或热抗原修复法来使蛋白与甲醛交联的醛键断裂开，以利于后来的染色。
甲醛可配成简单的或混合的固定液，最简单和最容易掌握的方法，就是取10ml甲醛液，加水90ml，这就是10%的福尔马林.当然,现在使用的固定液要求较为严格些,最好是使用缓冲福尔马林固定液,这将有利于后来的免疫组化染色的需要.从组织学的观点来说,甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点: 1.组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好.2.固定均匀,穿透力强.3.能使组织硬化,增进组织弹性,有利于切片.4.能保存脂肪及脂类物质.5.成本较低.虽然甲醛有上述的优点,但这都是相对而言,任何物质都不可能十全十美的,它也有许多缺点: 1.杂质含量较多,如甲醇,可钝化酶类,影响反应.
2.含有微量甲酸,导致固定液酸变,影响染色.3.可产生福尔马林色素,影响观察.4.不能固定尿酸和糖类物质.5.容易挥发,污染环境,可导致标本干涸.6.可长期存在于固定过的组织上.有人做过实验,组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后,仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合,但需要经过长时间的流水冲洗(24天的冲洗)方能除去.可见存在于组织上的甲醛是不可能除去的.因为临床活检不可能有这么长的时间来冲洗组织.因此要特别指出的是,在其后的各种技术操作中,要特别注意到甲醛的存在,必须要想办法除去它,否则将会给各种染色造成影响,甚至导致失败.应用甲醛,可以配成许多种固定液: 1.10%缓冲福尔马林固定液 甲醛
100ml 蒸馏水
900ml NaH2PO4·H2O
4g Na2HPO4 (无水)
6.5g 该固定液是当今流行的固定液,因它对组织固定较好,损伤较少,因对其后的各方面的研究都较好,尤其是对免疫组化的染色.
2、10%福尔马林固定液 甲醛100 ml
自来水900ml 这是一种最简单的固定液，适合于边远地区携带的固定液，但由于它的单一性，因此，只要有条件的单位都不要求使用这种固定液。
3、10%福尔马林盐固定液 甲醛100 ml 自来水900ml Nacl9克
先将Nacl溶于水，再加入甲醛。这也是一种较为简单的固定液，但由于加入Nacl，它是一种重金属盐物质，加入了它可促进和改善染色，增加染色的强度。
4、Bouin氏固定液 苦味酸饱和水溶液75 ml 甲醛2 ml 冰醋酸5 ml 该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用。而甲醛对组织有收缩作用。两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用。使组织固定达到优良的固定水平。 5．醛糖钙固定液 甲醛100ml 蔗糖300ml 乙酸钙20g
蒸镏水90ml 先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。
当前国内外基本上都还是要用甲醛来固定组织。从免疫组织化学的角度来说，甲醛固定的组织大部分都可以用免疫组化的手段来检测，据多人认为，它对lgA ，lgM，J链，K链和λ链的标记效果较好，且背景清晰。但美中不足的是：经它固定的组织，可与蛋白形成醛交联蛋白，这种醛键可封闭抗原。固此，在免疫组化实际检测中，应根据不同的要求和需要，采用酶消化或者其它抗原修复如微波、高压等的方法，以便破坏醛键重新暴露抗原。
（2）酒精：又称乙醇，为无色透明的液体，沸点是78度，工业酒精是95%。 酒精它有许多优点：
1、可保存尿酸结晶和糖原等物质。高浓度的酒精如95%，无水酒精可保存上述两种物质，因它们易溶于水，因此，要证明上述两种物质的存在，就不能用含水的固定液来固定组织。
2、能在任何比例的情况下与水混合，在病理技术中，酒精是一种十分重要的试剂，它起着关键的作用。如果没有酒精，将会无法完成必要的工作。如组织的脱水，
切片染色前后都离不开酒精，在常规的工作中，通常都用95%的工业酒精来配成60%、70%、80%、90%等不同的浓度来使用。
3、可溶解苯类物质为染色步骤中的桥梁试剂。常规活检等切片上的石蜡必须除去，才能进行染色，能除去石蜡的物质有苯及汽油等，常用的有苯类试剂，苯不溶于水，但能溶于酒精，酒精在这里充担着除去苯和连接水的作用，为切片入水架起了桥梁，因此称它为桥梁试剂。
4、能除去切片上的水份，使切片无水化。切片经染色后，由于所用的试剂都为水溶液，因此在切片上含有大量的水份，这些水份经系列梯度酒精的置换吸附后，到无水酒精中已完全无水，这样处理对于切片的保存是有好处的，否则，切片将会褪色。
5、可用来保存标本。大体标本经福尔马林固定后，如为了陈列保存，必须取出冲冼。然后移入75%的酒精中。如果用福尔马林作陈列标本的固定液，则因为福尔马林含有杂质较多，液体容易酸化，时间一长，会逐渐变为微黄色或淡黄色，影响美观，影响陈列的效果。
6、可与其它试剂配成多种的混合固定液，有时为了加快固定，常采用酒精和其它试剂来配成混合固定液，这种固定液在固定的同时，兼有对组织脱水的作用。应
用酒精配成的混合固定液有： ①
Carnoy氏固定液
氯仿
300ml 冰醋酸
100 ml 95%酒精
600 ml 该固定液固定组织快速，在固定的同时兼有脱水的作用。溶液中的氯仿和酒精，对组织的收缩较厉害，但应用了冰醋酸，这种现象便被中和去。 ②
AF固定液
甲醛
100 ml
冰醋酸
50 ml 95%酒精
850 ml 这种固定液的作用与上液有相似之处，但要注意的是，凡使用含有醋酸的固定液，其脱水用具不能使用铜制的脱水盒，因冰醋酸跟铜离子起反应，生成醋酸铜，这种物质可沉淀于组织间，可破坏组织中的抗原，造成免疫组化检测的失败。应用时应多加注意。 酒精也有许多不足之处，它的缺点是：
1、可溶解脂类物质，凡要证明组织是否含有脂类和类脂物时，切不能用含有酒精的固定液去固定组织，也不能用石蜡切片，因为酒精可将它们溶解去，而石蜡切片组织中含有的脂类物质，则在组织脱水时被溶解去，
只留下脂类或类脂物所占有的空间。
2、对组织收缩较大，不宜作单纯固定液。高浓度的酒精，对组织有显著的收缩作用，造成组织发硬易脆，难以切片等现象。因此，它不作为单纯的固定液。
3、渗透力不强。当用酒精固定组织时，组织表面很快就被固定，并形成了一层蛋白膜，这层膜可阻挡固定液向里渗透，造成了中间组织固定不佳的现象。
4、可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡经酒精固定的组织，核的染色都不好。
5、可脱去切片上已着染的各种颜色，切片经染色后，一是必须洗去多余的染液，二是必须脱去切片上的水。在用酒精洗切片时，必须仔细地掌握显微镜下观察，还要掌握酒精的浓度，低浓底的酒精脱色力强，稍不注意，便可脱去切片上大部分的颜色。切片脱水时，要较快地通过低浓度的酒精，以免使已着染的颜色被脱去。
6、价格较贵。从经济学的角度，应用酒精固定组织划不来，例如：一瓶500ml的甲醛，可配成500ml的固定液，按每例标本需要100ml计，可固定50例标本，而一瓶 500ml的酒精，即使配成80% 酒精，也只能固定6例标本，因此，若用酒精固定组织，其价格比用甲醛固定组织的要高8倍。
（1） 冰醋酸。冰醋酸为无色透明的液体，易挥发，气味大，一打开瓶盖，整个文章都可闻其味道，纯醋酸在17℃时常为结晶状，因称为冰醋酸，在冬天使用时，可用微波炉进行解冻，再行使用，它的优点有：
1、能迅速固定染色质，助于染色，用醋酸配成的
固定液，其作用快，固定效果均匀，对于染色质的固定快，因此，用其作固定的切片染色好，在配其它染色液如明矾苏木素和伊红时，常常需加入一定量的醋酸，以促进染色。
2、能使组织尤其是富含纤维的组织膨胀。
各种固定液对组织都有收缩的作用，尤其是对富含纤维的组织。而它不但不会使组织收缩，而且还会令许多组织发生膨胀的作用。根据这个特点，用它配成许多种不同的混合固定液，以达到固定好，收缩少，易切片，效果好等目的。用它配成的混合固定液有： （1） Zenker氏固定液：[6] 重铬酸钾
25G 升汞
50G 蒸馏水
1000ml 冰醋酸
50ml 先将重铬酸钾和升汞溶于水中，尢其是重铬酸钾，应用热水或加温的方法将其溶解，然后过滤贮存于带盖的玻璃瓶中，如暴露于空气中，
该溶液将会被慢慢氧化而便颜色加深，导致失效。临用时，取贮存液950ml，加入50ml的冰醋酸，即可使用。
应用该固定液固定的组织，一般不要超过24h，取出组织，流水冲冼12小时以上，然后保存于75%-80%的酒精中，在切片染色前，必须用碘除去汞盐的沉着。应用该固定液的组织，细胞核及细胞浆染色十分清晰，特别是要显示骨骼肌的横纹时，应用本液可获得满意的结果，但由于其含有醋酸，故不能用于保存细胞颗粒，红细胞及含铁血黄素。
（2） Flemming氏液 2%酸水溶液
200ml 1%铬酸水溶液
700ml 冰醋酸
100ml 该液中的奥酸对脂肪组织既有固定作用，又有染色作用，对有髓神经纤维也有固定兼染髓鞘的作用。如果做HE的染色，该液不适合。应用该液固定的组织，切片不能太大过厚，一般1-2毫米厚固定时间1-3天，后经水洗，保存于80%酒精中，除上述两液体外，还有Bouin氏液和Carnoy氏液等。冰醋酸也有许多不足之处：
1、不能作为单一的固定剂。冰醋酸在实际应用中，常被作为添加剂来使用，如许多种固定液，都加入了冰醋酸。另外，在苏木素和伊红染液中，也常加入了冰醋酸。
2、不能凝固蛋白质，不能保存白细胞颗粒，红细胞及含血铁黄素等。
3、价格较贵。
(4)
重铬酸钾是一种固体，粉末状，桔红色，具有毒 性，较难溶解于凉水，因此在配制时用较高温度的水来溶解，也较易发生沉淀。它的优点是：
1、能固定脂肪及类脂物。
2、为髓鞘及嗜铬细胞优良的媒染剂。
3、可配成多种的混合固定液 （1） Helly氏液[7] 重铬酸钾
25g 升汞
50g 蒸馏水
1000ml 甲醛
50ml 临用时加入甲醛，因其加入后于24小时后可发生沉淀而失效，因用时应特别注意。
该液是白细胞颗粒的优良固定剂，因此凡为白细胞或造血器官如骨髓，脾脏及患先天性梅毒之肝脏等，可用此液固定。 此液原配方要求加入硫酸钠，但据我们经验认为，硫酸钠在液中对组织无任何作用，故省去。 （2） Orth氏液 重铬酸钾
20g 蒸馏水
1000ml 甲醛
100ml
该液固定组织较缓慢，不适合于作临床的活检固定液，4毫米厚的组织固定时间需36-72小时，该液对于染色质的固定好，显示清晰，但可溶解部分红细胞和含铁血黄素。 重铬酸钾的不足之处有：
1、不能沉淀蛋白质，它必须和醋酸配成混合固定液，方能发挥作用，产生铬酸，沉淀蛋白质。
2、具有毒性及产生高温。在配制液体时，如清洗剂，当加入硫酸时，可产生很高的温度，并挥发出刺鼻的气体，应特别注意。
3、它不能长期固定组织，经它固定的组织应充分水洗后保存于80%酒精中。
（六） 氯化汞又称升汞，具有毒性。单独用于固定组织，对组织有较大的收缩力，故很少单独使用。它可使组织蛋白凝固，迅速硬化而形成白色硬膜，这是由于它穿透力极弱所致，因此它不适合固定较厚的组织。它常与其它的试剂配成混合固定液，彼此抵消各自存在的不足，使固定组织的效果非常好。应用升汞配成的固定液的优点有：
1、细胞核及细胞浆染色清晰。
2、对白细胞颗粒，造血器官如骨髓和脾脏等是优良的固定剂。
3、可配成许多混合固定液如：Zenker氏、Helly氏和Stieve氏等。
它的不足之处是：
1、容易产生汞盐沉淀。经升汞配成的混合固定液固定的组织，一是不能固定太长时间，经24h后冲水，然后保存于70%或80%的酒精中，二是在洗色前，都必须用碘除去汞盐的沉淀，以免由于汞盐沉淀在切片上而影响对切片的观察。
2、对组织有较大的收缩力且穿透力弱，用它不能固定过厚的组织，因穿透力弱，组织中间部分固定不好。
3、具有毒性。
（五）、微波辐射固定组织。[8]－[9]
组织固定的结果是组织中的蛋白质凝固，以保存组织中原有的微细结构。常规固定用的是甲醛或酒精等。但是这些固定剂从某些方面来说其穿透力不很强，因而需要较长时间的固定，另者，临床上的冰冻切片，有的应用快速加热法预先固定组织，造成福尔马林的极度挥发，污染环境，影响人们的身体健康，因此寻找其它固定组织的方法就成为研究的重点。微波辐射固定组织，就是在这种情况下产生的。
微波是一种具有能量的电磁波，在其运动期间可产生瞬间热。由于微波的快速运动，也导致了物体内部极性分子的快速运动，产生了热量，致使组织蛋白凝固，因此，旧的叫法称微辐射固定组织。按实际的应称为微波辐射凝固蛋白。
1、组织固定温度和时间的选择。
究竟微波产生的热量需要多高，才级使蛋白凝固的呢：Maon氏等人的研究表明，700-90℃，对没有固定的蛋白可发生变性。
Bernard经过一系列的研究后认为，肝、肾、肺的最佳固定温度是70℃，和77℃，因为各种组织的结构不同，成分不一，电子密度不一样，因而固定所需要的温度也不样。我们的实验认为，65℃左右的温度可适合于各种组织，条件是固定取小块材料，时间在截取3-4min。
2、微波炉档次的选择
目前市售微波炉品种繁多，要选用合适的微波炉，必须根据各人的使用习惯和爱好。微波炉一般分为高火、中火及低火。使用时要进行系列实验。例如多少ml的固定液需要多少时间达到多少温度，用的是哪一档次的火等。
3、微波辐射需固定液的选择
张素娟等应用临床活检新鲜组织如：甲状腺、乳腺和淋巴结，实验小鼠的肿瘤、肝脏、肾脏、心和肺等组织，分别用10%的福尔马林和生理盐水经微波辐射后，通过HE、网染、AB-PAS以及几种抗体如CEA、EMA和L26等的检测后发现，生理盐水的结果最好。
一提固定，以往总与福尔马林分不开，而经微波辐射后的固定效果，竟然比前者好，这就解决了一大难题，即快速石蜡切片及冰冻切片的组织固定，以往用加热固定的方法，其结果导致福尔马林蒸发，使整个房间都充满福尔马林气味，既污染了环境，也影响了身体的健康。虽然生理盐水用微波辐射后对组织有良好的固定效果，但是它只能适合于少量的快速制片和某些
研究，绝不可能适合于大批量的活检。因为活检取材，现目前组织的制作，都基本上用机器来进行，而所用的脱水盒，有铜和不锈刚的金属物所制成，组织取材后，一个一个的盒子装着组织，如果除去金属来用微波固定，这是不现实的事情。另外，微波辐射，它的穿透力较弱，大量的组织块，其中间是达不到要求的。
第四节
病理制片程序
一常规石蜡切片制片法
组织经系列酒精的脱水，经透明剂的作用，经熔化的石蜡的浸渍，包埋后所切成的切片称为石蜡切片。它适合于尸体解剖，临床活检和某些科研的切片。
（一） 组织脱水
把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。不管是正常的组织，还是有病变的组织，都含有不同程度量的水分。据测定，人体的物质组成约含水55~67%，蛋白质15~18%，脂类10~15%，无机盐3~4%及糖类1~2%[14]。如果不把这些水分脱去，石蜡切片将无法进行，因为石蜡和水不能混合在一起，所以除去组织中的水分成为制片中的关键，用什么物质才能担当起这个重任呢，至今为止，国内所用的都是酒精。因它不管在什么样比例的情况下都能和水混合，所以它可以慢慢地将水从组织中置换出来。酒精脱水力强，对组织又有硬化和易脆的不良影响。在使用时，通常是从低浓度至高浓
度，浓度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，组织经过这一系列处理后，基本可达到脱水的目的。临床上如使用含酒精的固定液固定组织时，(Carnoy氏、AAF液)组织不需要经过低浓度的酒精，可直接进入95%酒精脱水。 组织脱水，目前常用的有两种方法
1、人工组织脱水法
该法经济实惠，灵活度高，可根据不同的组织及其大小来确定脱水时间，也可根据不同组织及大小分批进行脱水，其优点是：
1、可根据不同的组织及大小，任意增减脱水时间，达到脱水目的。
2、可随时观察组织的变化，随时中断组织的脱水，不使组织过度硬脆。
3、可以多层次地进行脱水。 缺点
1、需耗费人力，每个步骤的递增都需要人工完成。
2、不能大批量的进行脱水。
3、必须在班上完成脱水或者定点于某一浓度的酒精中过夜，晚上无法进行梯度递增。 （2）、自动组织脱水机脱水法
自动组织脱水机的机型品种繁多，大小不一，国内生产的轨道式和圆盘式两种，国外生产的有圆盘式和柜式两种，上述国内外四种型号的机子，我们都使用过，根据使用的效果做一简单
介绍。
1、轨道式自动组织脱水机。这种机子容量小，脱水用的试剂不足一升毫升，组织块脱水用的提篮小，每次只能容纳40块组织左右，它适合于较小的单位，但不适合于大单位。另外，该机在运转时，装试剂的盖子打开，试剂容易挥发，污染环境，对人身体健康不利。
2、圆盘式自动组织脱水机。国内生产的这种机器容量也不够大，每天处理组织块，40块左右，如果大的病理科每天需要处理150块左右组织块时，需要这种机器4台左右。这种机器脱水时也属于揭盖式的，因此，试剂容易挥发，特别在夏天，必须经常添加试剂，以补充被挥发去的试剂。这种机器，对环境同上述机器一样。国外生产的也有同类产品。
3、全密闭柜式电脑控制自动组织脱水机。
这种脱水机由电脑、反应缸和试剂贮存缸三个部分组成，这三部分可以分开使用，也可以结合在一起，形成一个柜式，一台电脑可控制5台脱水机。电脑功能包括时间、温度和真空负压等，可在小荧屏上显示出来，同时可显示正在进行的脱水程序。根据需要，该机可编九套程序输入电脑，我们的编程如下：第一套为正常室温下脱水程序，该程序在换新试剂的几天内使用。第二套程序组织块脱水不充分时启动使用，当第三套程序的组织块脱水不好时，则应更换新液；第四套为周末程序，该套程序根据两天的休假时间，安排好组织块的脱水时间。第五套为
“八一”程序，第六套为“十一”程序，第七套为元旦程序，第八套为春节程序，这后面几套为节假日程序，根据节假日的放假时间不同，编排不同的程序。反应缸内在15秒左右的时间里抽入反应所需的试剂，当按程序表的时间反应完毕后，在15秒左右的时间，将其送回贮存缸，然后则另换其它试剂，如此反复，直至整个程序完毕。试剂贮存箱内由12个缸组成，每个缸的容量为2.25升。其中用于装固定液的缸1个，装酒精脱水剂的缸7个，装透明剂的缸为2个，另有2个缸，一个装二甲苯，当石蜡在反应缸中完成或浸蜡后，被送回蜡缸（在反应缸的右边）后，用以清除遗存的石蜡，还有一个缸装无水酒精，用以清除遗存的石蜡，还有一个缸装有无水酒精，用以清除二甲苯的残存液。
根据我们对各种不同的脱水机的应用比较，认为这种脱水机有以下特点：
1、该机容量大，每次可处理组织块250-300块，这对于大、中等医院的病理科较合适。
2、全部密闭，所有的试剂都由管道输送。这样一是保证了试剂不挥发，尤其是夏天，室温较高，试剂挥发快，如为揭盖式的脱水机，试剂挥发的程度无法形容，几乎每天都必须添加，这样试剂用量大，二是对环境污染不明显，保证了舒适的工作环境。
3、带有定期的搅动装置，如此可使组织固定均匀，脱水彻底。
4、整个过程过置于真空负压的条件下来进行，尤其是浸蜡，可节省1/3以上的时间，浸蜡充分彻底，尤其是对多孔的组织如肺组织，效果更明显。 脱水机脱水的优点有：
1、组织脱水均匀；
2、能在无人在的情况下完成组织的梯度递增，完成脱水，透明和浸蜡程序，如此可节省人力物力。
3、能大批量地处理标本。 脱水机脱水存在的不足：
1、由于机子的的原因，在脱水时，大小组织一窝煮，造成小组织过度处理而产生硬脆的现象，使之难以切成佳片。
2、如为揭盖式的脱水机，液体容易挥发，污染环境，影响工作条件。
（二）组织的透明
组织经过一系列酒精的处理后，虽然组织里所含有的水分已基本上被脱去，但是组织脱水时机里可残留着许多酒精，如果不将其去除掉，必然影响组织的进一步处理，酒精不能溶解石蜡，必须寻找一种既能与酒精混合，又能溶解石蜡的试剂，方能使石蜡浸入到组织中去，这类物质被称为透明剂。它们是二甲苯、苯、三氯甲烷（氯仿）、香柏油、苯酚、松节油和汽油等。虽然透明剂种类多，但根据性能及效果看，还是二甲苯为最好。 二甲苯是一种透明无色的液体，挥发性强，打开后即可闻其味
道，能溶解石蜡，能溶于酒精及丙酮等，但不能溶于水，它是一种良好的透明剂，组织经充分脱水后放入该试剂，视组织的大小、种类的不同，确定不同的时间，便能达到透明目的。在一般的情况下，胃、肠粘膜透明时间5-10分钟，鼻咽部及排出物为15-20分钟左右，子宫肌瘤、平滑肌组织为60-120 分钟。总之组织的透明，应视组织的大小而定，不能千篇1律，要经常观察组织的透明情况，组织一经透明，就必须从二甲苯中取出。因为二甲苯对组织的硬化程度特强，如果在其放置过长，就会引起组织的硬脆，难切片。如果组织在二甲苯放置到一定时间后，仍没有达到透明，组织块中间可出现粉白色的现象，这说明组织没有完全脱水，处理这种情况有两种方法，一是将其重新放入酒精脱水，然后再透明，这种方法处理的组织很硬，切片较难。另一种方法就是重取材。如果将没脱水好的组织继续做下去，切片将不完整。或者无法切片。
二甲苯及苯类物质被认为是一种致癌性的物质，许多单位和个人都不敢用或尽量少用，或者在切片染色至酒精后，将切吹干就进行封片，这种做法是非常糟糕的，以往切片的整个制作程序都强调不要使切片干涸，上述做法将会影响切片颜色的保存。 其它的透明，由于作用较为缓慢，不适应于临床活检，但为了某些研究，也可以使用一些缓慢性的透明剂，如此可使切片较为舒适，效果较好。
（三）、组织浸蜡
组织经过透明剂的完全透明后，被移放于65c左右熔化的石蜡中，于65c的电热恒温箱中浸渍的过程称为浸蜡。
组织在脱水时，组织中的脂类和类脂等物质在脱水剂的作用下被溶解掉，留下了许多腔隙，许多管腔组织和血管，也有许多腔隙，这些都严重地影响了切片。组织浸蜡时，由于诱导剂（二甲苯）的作用，石蜡进入到组织的各个角落，并在各个角落中保存下来。当石蜡包埋后冷却时，这浸入到里面的石蜡便可起到支撑的作用，而且使组织不致于变形，塌陷等现象，使切片能完整的切出，便于镜下观察。
组织浸蜡据多次文献报到必须换几次不同熔点的石蜡。石蜡有软蜡和硬蜡之分，软蜡的熔点有45C、52~54C。硬蜡的熔有56~58C，58~60C、60~62C。浸蜡的顺序 是先软蜡，后硬蜡，浸蜡的时间根据组织不同而确定不同的时间。有的人指出组织浸蜡先放入二甲苯与石蜡等份混合的液体中浸渍然后再放入软蜡、硬蜡。根据使用经验我认为不必要这样做。因为组织经二甲苯或其它透明剂透明后，在组织进入石蜡时，自己还带着残存的透明液，如为手工操作，可将组织块控干，尽量减少残存液的存在，而自动脱水机则不然 ，组织可存留一定量的透明剂，经使用次数多次后，残存的透明剂可把石蜡稀释。因此机器程序处理的次数较多时，应注意换石蜡，以防组织浸蜡效果不好。
（1） 石蜡的性质
石蜡是一种碳氢化合物，由矿物油的分裂产生，它的性质是相当的不同，其熔点在45~62C之间。熔点高的为硬蜡，硬度较
高，适合于夏天切片的用蜡，熔点低的为软蜡，54C以下的称为软蜡，这种适合于组织化学的切片用蜡。根据石蜡的特点，根据季节的不同，合理地使用不同熔点
的石蜡，这是能否切好片，使切片产生带状的关键。 （2） 石蜡性质的改善
为了获得较好的连续切片，人们想出了许多种方法，对石蜡进行改造，使石蜡的硬度和柔软性更适合于佳片的切出，提出了许多种方法：
1.石蜡加热冷却法
刚购入的石蜡,不管是动植物切片石蜡也好,还是工业用蜡也好,都必须进行处理,方法是:将石蜡放于容器里,于电炉上加热,此时石蜡遇热熔解并发出哔哔吧吧的声音,这是石蜡中含有的杂质,遇热后分解所发出的声音,随着时间的延长,温度的升高,这种声音将逐渐减少,直至消失。此时可将盛装石蜡的容器浸入冷水中，石蜡凝结后，再继续加热，如此反复几次即熔化—冷却—熔化—冷却。这种处理方法，可增加石蜡的密度和可塑性，除去杂质。为达高质量的切片，这是必经之法。
2、增加和改善石蜡的韧性和粘度
这种方法则需要加入一些东西才能获得，如蜂蜡和硬脂肪，蜂蜡最高熔点可达70余度，增加它可增加石蜡的硬度。石蜡切片切4—5um，60C左右的石蜡可支撑得起，如要切1~3um，其硬度则不够，因此，要制出较薄的切片，石蜡硬度一定要过关。
另外，增加石蜡的硬度还可以加入脂蜡酸、柏油、杨梅蜡等，虽然如此，石蜡经处理后，用时的颜色如肥皂一样为最好。
在了解了石蜡的性质及如何改造它后，下面再了解组织浸蜡。
（3） 传统浸蜡法
这是手工操作和不带真空负压的浸蜡方法。根据石蜡的熔点，确定浸蜡箱的温度。如硬蜡的熔点为62C,浸蜡箱的温度应比石蜡熔点高出2~3C，即浸蜡箱调在65C，当确定好后，将组织放入软蜡，后转入硬蜡，根据不同的组织，组织的大小来确定浸蜡时间，小组织20~30分钟，大组织几个小时不等。 （4） 真空负压浸蜡法
真空负压浸蜡法应用一真空泵，将箱内的空气抽出来，形成真空负压，在这种条件下，由于失重，各种分子活动加快，促使浸蜡过程迅速完成。为了浸蜡完全彻底，全密闭自动脱水机配有这一功能。
鼻咽部、宫内膜
甲状腺、肝、脾
子宫肌、平滑肌
所需
穿剌物、排出物
肾、淋巴结
胃、肠、横纹肌等
温度
传统浸蜡法
40—90 min
90—150 min
180 min以上
65度
真空负压浸蜡法：15 min
25—30 min
60—120min
70度
真空负压所需压力表：40KP
40—53KP
66、7KP 真空负压浸蜡法使用时的注意事项：
1、真空恒温干燥箱的温度应略高于传统浸蜡法，因为在抽气形成真空时，箱中的热气会被抽出，致使箱中温度下降，使熔化的石蜡凝结成块，所以温度调至70度左右为宜。
2、计时应从浸蜡完全熔化时计起。抽气时，箱中的温度下降，此时浸组织块的蜡如果处于凝固时，应待其熔化后，方可计时。 附：几种组织处理程序。 （1） 常规组织处理程序
1、
2、
3、
4、
5、
6、
7、
8、
9、组织块冲水24小时。 70%酒精24小时。 80%酒精12小时。 90%酒精12小时。 95%酒精（1）2小时。 95%酒精（2）2小时。 100%酒精（1）1小时。 100%酒精（2）1小时。 二甲苯（1）30—60分钟。
10、二甲苯（2）30—60分钟。
11、软蜡1小时。
12、硬蜡2—3小时。
（2） 胃肠粘膜处理程序
1、
2、
3、
4、
5、
6、
7、70%酒精10min。 80%酒精10min。 90%酒精10 min。 95%酒精10min。 100 %酒精10min。 二甲苯5—10 min。 浸蜡15 min。
（3） 临床手工脱水法。
1、
2、
3、
4、
5、
6、
7、80%酒精过度。 95%酒精过夜。 100%酒精（1）1小时。 100%酒精（2）1小时。 二甲苯（1）30—60 min。 二甲（2）30—60 min。 浸蜡（真空负压）90—120 min。
（4） 全密闭柜式自动脱水机脱水法（室温）。
1、
2、
3、
4、
5、10%缓冲福尔马林2小时。 90%酒精2小时。 95%酒精2小时。 95%酒精
1、5小时。 95%酒精1小时。
6、
7、
8、
9、100%（1）酒精1小时。 100%（2）酒精1小时。 100%（3）酒精1小时。 二甲苯40 min。
10、二甲苯40 min。
11、石蜡（1）1小时。
12、石蜡（2）1小时。（共14小时50 min。） （5） 全密闭柜式自动脱水机脱水法（加温至40度）。 （6） 全密闭柜式自动脱水机脱水法（真空负压）。 注：（5）、（6）法详细步骤同（4）法。 （7） 全密闭柜式自动脱水机周末脱水法。
1、
2、
3、
4、
5、
6、
7、
8、
9、10%缓冲福尔马林20小时 90%酒精20小时。 95%酒精5小时。 95%酒精5小时。 95%酒精3小时。 100%酒精3小时。 100%酒精1小时。 100%酒精1小时。 二甲苯40min。
10、二甲苯40 min。
11、石蜡（1）1小时。
12、石蜡（2）1小时。（共61小时20分钟）
注：上述的临床程序都是以当天17：00钟取材完毕后所设定的时间，17：00—第二天的8：00，刚好是15个小时，要想在8：00上班时包埋组织块，就必需设定准确的时间，否则将会延误其它的时间，还有其它的如“五一”程序、“十一”程序和“春节”程序等，这些要根据休假的具体日期来确定每个步骤的时间。
（四）组织块包埋
随着科技的发展，组织块的包埋由简单的人工包埋转向用机器的半自动包埋。
（1） 石蜡包埋机包埋法：
1、
2、
3、
4、打开电源总开关，让包埋机处于工作状态。 调高温度，让包埋蜡温至65度左右。 打开冷冻台。
取出包埋模型，由脚踩踏或手控出蜡制，注入少量的石蜡后，挟入组织块，小的多块组织应放在一起，大块组织应压平，管状和皮肤组织应竖起来包埋，然后再压上包埋盒，包埋盒上再注入少量石蜡，包埋完后，将其置于冷冻台上，旁边备有一盒冷水，当冷冻台上的包埋块表面出现凝结时，迅速将它放入水中，然后取出蜡块，修削去周边的余蜡，按顺序排列好于4C冰箱或冰格中冻起来备用。
（2） 传统包埋法
1、将包埋框合成模型槽，注入石蜡。
2、打开组织块脱水盒，取出组织块，把平整的一面朝下，用镊子轻压，保持在一平面上。
3、每包埋完一块组织块，即将标签附上，以防出错或张冠李戴。 （3） 组织包埋时的注意事项
1、传统包埋使用的镊子、包埋框，都必须放于40C的恒温箱内，否则在没有暖气设备的冬天，熔化的石蜡遇到冰冷的器械回马上凝固，影响包埋。
2、传统包埋法使用的包埋框有多种，如铜和铝制品，，但以铜的为优，因铜的散热较快。
3、包埋的石蜡温度不宜过高，否则注入模型时，会四处溢流。
4、组织块本身的蜡不能凝固，如果凝固了，应放回重新加温，使其熔化，否则会影响切片，或整块崩出，破坏组织块。
5、包埋完后，应待蜡块完全凝固，方可放入水中，否则未凝固石蜡会被水挤走，漂浮于水面，造成包埋块蜡块的缺损。
6、小的多块的组织应包埋在一起在一水平面上，否则切片美观度不好，深浅不一的包埋会使有的切上，有的切不上或被修削去。
（五）蜡块的修切
不管是组织包埋机包埋的蜡块也好，还是传统法包埋的蜡块，切片前都需要很好的修切，才能更适合于切片。前者包埋的蜡块，包埋盒周边的石蜡，一定要去除掉，否则切片时，切片机上的持蜡器，将无法将其夹上，影响切片中间的部分，视组织的大小而确定是否需要修切，比如组织小米粒大小，这时应将周边多余的石蜡削去，
按要求组织块周边的余蜡留有0.5CM即可，削去余蜡后，对于细小的组织，一张玻片可以多裱上几个组织块，对于疾病的观察大有好处。削去余蜡的另一个好处是延长切片刀的使用寿命，保证一把刀（一次性刀片）多切一些蜡块，因为余蜡的存在，在切片时，增加了刀口的磨擦，使刀口容易钝化。传统包埋法的蜡块，如为原始的包埋框所包埋的蜡块，在分切蜡块时，应特别小心，以防损坏分切的蜡块，造成切片的困难或难以形成连续切片（组织周边余蜡存留太小或没有）。目前大多数使用的是包埋盒，但包埋盒边上多余的石蜡也要修切去，否则妨碍蜡块上机切片。
（六） 石蜡切片。
组织块经过一系列的处理后，便准备切片，切片是检查验证前面系列处理程序是否合适，如果不合适，便可在切片时显示出来，比如组织脱水不好，组织表面将出现白色状，切片肯定不好；如果浸蜡不彻底，切片也不能切出来；如果组织脱水或浸蜡过度，切片时呈粉沫状或者呈波浪状。总之切片是个关卡，任何虚假或马虎都行不通。 切片时必须具备的工具有：
（1） 石蜡切片机，目前，国内外常规使用的切片机有两种型号，它们是：
1、轮转式石蜡切片机，根据不同的情况，根据使用的习惯性来确定使用的机型，但据我所知，目前国内使用的机型，绝大部分是这种型号，这种机型，购买时只要选购好机子，使用起来就能得心应手，操作便利，换切蜡块快速，可制作连续切片。尤其是教学片，
有更大的好处。
2、平推式切片机（轨道式）这种机子虽然也有它的优点，但从目前国内使用的单位统计，是占很少一部分，这种机型，单一切片，比较费力。
（2） 切片烘烤箱，这种箱子可以自做，也有市售。
1、市售切片烘烤箱，该箱配有裱片用的温水控制部分，另一半为切片的烘烤部分，温度可进行调节，范围在0—100度间，边切片边烤片，这是最为理想的手段，其好处是，如果裱片时，有个别小部没裱好，发生皱折，及时的烘烤可将其烤平。另者，当切完最后一张时，前面的已烘烤差不多了，不用再费多少时间就能烤好切片。
2、自做烘烤箱，这根据各单位的情况进行制作，可以制作一个木箱，上面用铝板制成，在前部挖一个口子，刚好放进一个铝制饭盒，这个可作为裱片用，内将四个40—60W灯泡，外装开关控制，这便是一个烘烤箱。
（3） 小镊子，小驼毛笔，切片刀或一次性刀片，玻片等。小镊子最好选用眼科用的弯小镊子，这对于挟取微薄的切片较有用，如果用大镊子很容易弄破切片，选用的毛笔以驼毛笔为好，因为这种笔柔软，不易弄破切片。切片刀最好选用一次性刀片，这种刀片好处有不用磨，节省人力和物力；如果刀片出现缺口，可另更换刀口，直至丢弃，而大的切片刀就不可能这样使用，如果刀有切口，就要将刀口磨去，磨去刀口是很费时的。
（4） 切片。装上切片刀，装上蜡块，修平切面，如果没有特定标志，
原则上是暴露组织的最大切面，定好切片的厚度，一般切片在4-5um。肾穿切片一般厚度在3um以下，切片时，注意力要集中，认真挑选佳片，切片完毕，应注意保养切片机，使之处于良好状态。保养时，滑动面要滴上油，以利滑动及旋转自如，还有防锈作用。切片完后，除去残留蜡，除去切片刀，先用湿布擦去余蜡，继用干布擦干，再用油布擦一遍，最后用罩盖好切片机，以防灰尘脏物落于切片机上，影响机器的滑动灵活性。除了切片机要保养外，如为切片刀，必须保养，切片刀要经常磨，保持锋利的刀口，如果发现切片刀有刀口，要想办法除去，每次用完刀后，用布擦干净，再用油布擦，以防刀口生锈，影响切片。
（七）裱片
将漂浮于水面上的已展开没有皱折的切片捞于载玻片上的过程称为裱片或捞片。现在市售的烘烤箱都与裱片器连在一起，裱片器上的水温在界定温度后，它可自动调节。裱片时水温很为关键，一般在45-55℃，如果水温过高，超过石蜡的熔点，切片将会被熔化掉，如果水温过低，在30度以下，切片则裱不好，皱皱巴巴，不能完成展片任务。
切片放入水后，在合适的水温中它会自然展开，有个别没有展开的，用小镊子慢慢将其展开，镊子的用力要恰到好处，如果用力过大，切片会被搅破，如果用力不对，切片无法展开。应特别注意。当切片展开后，用载玻片（有人喜欢用蛋白甘油涂于载片上，但据我们二十几年对二十几万张活检切片的经验，没有蛋白甘油涂片也能行）插入
水中，靠近展开的切片捞于载玻片上，捞片时应尽量保持裱片器中的水不晃动。一张载玻片可以捞一张切片，也可以捞数张乃至十几张，这要看组织的大小和病理的需要，一般说大的组织捞一张切片就已足够，小的组织最好就要求多捞一些。
（八）烘烤切片
切片的烘烤看似简单，只在烘烤箱或干燥箱一放，让其烘烤就行了，但从某种意义上讲，它也是一个关键，如果切片烘烤不好，到染色的时候，便会使切片脱离载玻片（掉片），使整个过程毁于一旦，因此，认真烤好切片是制好切片的前提。怎样才能使切片烘烤得好呢？我们的做法如下：当切片裱于载玻片后，于烘烤箱边竖立起来，控干水份，然后平放于烘烤箱的烤板上烘烤，温度可调至70℃。当最后一个蜡块切完后，前面的切片也烤得差不多了。
关于切片的烘烤，尤其是需做免疫组化切片的烘烤，要特别的注意对抗原的保存，使它们能在合适的烘烤切片时间内既不受到破坏，又能尽量地显示出现，经多组多次的实验认为，温度和时间是极为重要的。温度过高能使蛋白变性，抗原失活至丧失，时间过长，也会致使其失活和丧失。最初有人主张切片在60℃以下烘烤30-60min，然后进行染色，依此法进行实验，结果切片脱片率高，切片松动的占100%，由于切片附贴不牢，染色时不敢用PBS充分冲洗，造成背影染色加深，鉴别特别困难。又由于脱片严重，重染次数增多，延误了诊断，也造成人力物力的浪费。究竟什么样的温度及时间才能做到既使切片附贴牢固，又不会对抗原造成影响的呢？经实验证明：切片在
60℃恒温箱中连续烘烤3-5小时最为合适。这种时间和温度烘烤出来的切片，可以用于抗原修复，PBS的冲洗，可满足做免疫组化的一切需要。切片在上述的烘烤时间和温度是否对抗原有影响呢？笔者认为，不必为此而担心。因为活检组织块浸蜡时，浸蜡箱的温度都调在65℃左右，组织块在这样的温度中起码要浸泡2小时以上，才能达到浸蜡较为彻底的要求。组织中的抗原，经过65℃的考验，保留下来的，基本上都已具有耐热性，因此，几小时的烘烤，不会对抗原有影响，实验证明，上述的理论完全正确。
（九）切片的普通染色
普通染色又称常规染色或HE（Haematoxylin and eosin）染色。它是病理技术中最常用的一种方法，通过它可以做出病理诊断和发现寻求别的辅助方法，以达到准确，完整的病理诊断。 （1）染色目的
病理学的所有切片，都必须通过一种以上的染料，通过各种不同的方法，将切片中各种不同的物质，在不同染液的作用下，将其显示出来，使之在光学显微镜下，能够完全的观看各种结构。例如，HE染色，好质量的切片可以清晰地显示出许多不同的结构，细胞核着蓝黑色，细胞浆着粉红色，软骨着蓝色等。清晰的结构为诊断提供可靠的依据，因此，染色技术也是病理技术中的重要组成部分，必须不断地总结，方能提高。如果染色不好，切片染色一团糟，红蓝不分，结构不清，层次不明，影响了镜下的观察，直接影响了临床诊断，染色结果的好坏直接关系到诊断的准确性。
（2）染色的作用
1．化学作用：所有的染色液中，可把它们分为两种类型，一种为酸性，另一种为碱性。酸性染料中有染色作用的为阴离子；碱性染料中有染色作用的为阳离子，每个细胞也存在着两种物质，细胞核含的是酸性物质，细胞浆含的是碱性物质。在染色时，细胞核中的酸性物质与苏木素染液中的阳离子发生作用，细胞浆中的碱性物质与伊红染液中的阴离子发生作用，由于反应的部位不同，结果着色有异。 2．物理作用：在染色过程中，染液中的色素微粒子浸入到被染组织的粒子间隙内，此时，因受分子的引力作用，色素微粒子被吸附而着色。由于各种组织有不同的吸附能力和不同的吸附程度，因此就可显出来不同的颜色来。
一般来说，染色的学说还有许多，但说服力强的仅有上述两种。但不管怎么样解释，实际上完成的每一种染色，都与上述两种学说分不开，它们的作用是相辅相成，同时存在的。 （3）染色方法及步骤
1．人工苏木素，伊红染色法（HE法） ⑪切片浸入二甲苯中5-10min； ⑫切片浸入二甲苯中5-10min； ⑬100%酒精1min。 ⑭100%酒精1min。 ⑮95%酒精1min。 ⑯95%酒精1min。
⑰90%酒精1min。 ⑱80%酒精1min。 ⑲自来水洗1min。
⑳浸入苏木素染液浸染10-15min。 ⑴自来水洗30second-1min。 ⑵1%盐酸酒精分化30second。 ⑶流水冲洗15min以上。 ⑷1%伊红酒精染3-5min。 ⑸90%或95%酒精分化30sec。 ⑹95%酒精30sec-1min。 ⑺95%酒精30sec-1min。 ⑻95%酒精30sec-1min。 ⑼100%酒精1min。 ⑽100%酒精1-2min。 (21)碳酸二甲苯1min。 (22)二甲苯1-2min。 (23)二甲苯1-2min (24)二甲苯1-2min。 中性树胶封固。
结果：细胞核被染成深蓝黑色；细胞浆被染成粉红色；软骨及钙盐被染成蓝色；胶原纤维染成淡粉红色，嗜酸性细胞及嗜酸性颗粒呈鲜红色；弹力纤维呈淡粉红色；某些蛋白性物呈粉红色等。
