暑期实习小结
00511130 刘琰
Notch是广泛存在于真核细胞的细胞膜上的受体，在哺乳动物中有4种（Notch1，Notch2，Notch3，Notch4）。配体主要有两种，Delta与Serrate，后者在哺乳动物中为Jagged。受体与配体相互结合后会导致Notch胞内序列（NICD）的释放。而这一段序列能够进入细胞核中并与DNA结合蛋白CSL（CBF1，Su（H）和LAG-1）和共激活因子Mastermind（Mam）相互作用导致一系列基因的表达，并通过这些基因产物决定细胞的分裂分化过程。
这个暑期在华盛顿大学的两个半月的实习过程中，我和一个博士后主要致力于Notch受体三个方面的工作。
首先是N1Cre190小鼠的相关组织中Notch的活性的检测。通过转基因的技术使得小鼠的Notch1蛋白后接上一个重组酶Cre，然后将这个小鼠与含有lacZ基因的小鼠进行杂交，子代的小鼠会在Cre的作用下切除位于lacZ前阻碍其表达的一段DNA序列，启动lacZ的表达，我们因此能够通过X-gal对组织染色来观察在组织中的具有Notch活性的细胞。这个实验小组在之前有进行过N1Cre28老鼠的相同的实验，但是在N1Cre28的老鼠中，N1Cre的表达活性较低，经研究可能有几个原因，第一是融合蛋白中加入的6个Myc-tag结构会导致蛋白的稳定性降低。第二是C段的SV40多聚腺嘌呤（用于增加蛋白的稳定性）序列加反了。更正了这两个的N1Cre190的小鼠中有更高的lacZ活性。除了利用lacZ，我们还是用YFP、V1744等方式进行相关的鉴定。而且，我们补充了一些成年小鼠内Notch1活性的数据，使得相关的结论更加的充分。
前面已经提到Notch有四种受体，Notch1只是其中的一种，我们也对Notch2的活性也进行了检测，同时与Notch1的实验结果进行。结果显示，在很多的组织结构中，这两种受体的分布并不完全重叠，特别明显的是在神经管、肾脏和皮肤中的分布。这对研究各组织的发育有着很重要的作用。
虽然Cre-flox系统十分有效，但是有比较明显的缺点，就是在这个系统中，细胞只要一旦Notch被激活，该细胞分裂产生的细胞将都会获得lacZ活性。因此我们无法判断某个细胞是否真的具有Notch活性，或者何时获得Notch的活性。为了解决这个问题，我们建立了CreERT系统。ERT是一段蛋白质序列，在一般情况下会导致蛋白质无法入核，在加入药物Tomaxfin后会使含有ERT序列的蛋白质进入细胞核中。在Notch受体上加上ERT后，我们就能通过药物的注射来控制lacZ被活化的时间，能够判断在不同时间和发育阶段具有Notch活性的细胞和结构。这对干细胞等特殊细胞的发现可能有促进作用。因为在小肠中，Crypt结构在用药物处理后具有lacZ活性，证明这些细胞在进行分化，可能是干细胞。同样的可能性也出现在肝脏中。当然，我们在实验时也有问题，例如在ERT的老鼠中，毛细血管都有很强的lacZ活性，对这个现象目前没有很好的解释。
除此之外，我们还开始进行新的转基因老鼠的培育工作，但是由于这个实验还在初始阶段，很多数据还不能公开，因此不在这里进行详细的描述。
除此之外，在国外实验室这两个半月的实习也让我学到了很多知识之外的东西，例如他们的高效率。实验室的工作时间是九点到下午五点，但是在这八小时的时间内，节奏很快，而且他们会同时进行两到三个实验的工作。同时，对于实验结果的态度十分的严谨，虽然能得到好的结果，但是会重复很多遍以提高说服力，有时还利用不同的方式。例如对神经管的Notch1的分布的研究。
