这份是2014级某人整理的，基本上都是上课涉及到的内容，里面“生物大分子（DNA,RNA,蛋白质）提取分离纯化的具体方法没有，分子生物学新技术几个名解就写啦CEMS，miRNA太多（可能是热点吧„），RT-PCR没有具体，基因诊断实例缺。 其他的基本上都有啦。
分子生物学：从分子水平研究生物分子的结构与功能从而阐明生命现象本质和生命过程规律的一门交叉科学 ；主要研究遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。 遗传学角度：基因（gene）：是指携带有遗传信息的DNA或RNA序列，也称为遗传因子。
分子生物学角度：基因（gene）：是合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA，包括编码蛋白质或RNA的核酸序列及为保证转录所必需的调控序列。
结构基因 ：可被转录成mRNA，并可翻译成多肽，构成结构蛋白或催化各种生化反应的酶。 调节基因 ：指某些可调节、控制结构基因表达的基因。
编码区：能够编码产生蛋白质的序列，包括外显子与内含子。 前导区：位于编码区上游，相当于mRNA5′端非编码区。
调节区：包括启动子和增强子等基因编码区的两侧，也称为侧翼序列。
断裂基因（splite gene）：真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因 基因组（genome）：是指一个物种的单倍体的染色体所携带的全部遗传信息。
C值（C value）：一种生物体单倍体基因组的DNA含量总是恒定的，它通常称为该物种DNA的C值。 C值矛盾：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象（又称：C值悖论，C value paradox ）
必需基因：指关系到生物体存活的基因，可通过基因突变的方法确定致死位点的数量，以得知基因组必需基因的数量
重叠基因（overlapping gene）是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。
多顺反子mRNA：DNA序列中功能相关的蛋白质的基因丛集在基因组的一个或几个特定的部位，形成一个功能单位或转录单元，它们可被一起转录成含有多个mRNA的分子。 病毒基因组的结构与功能特征？ ① 病毒基因组基因组很小，且大小相差较大。 ② 病毒基因组可以由DNA组成，或由RNA组成。 ③ 多数RNA病毒的基因组是由连续的RNA链组成； ④ 基因重叠。 ⑤ 基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质。 ⑥ 形成多顺反子结构（polycistronie）。 ⑦ 病毒基因组都是单倍体（逆转录病毒除外）。 ⑧ 噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的，而少数真核细胞病毒的基因是不连续的。
类核（nucleoid）：是指原核生物基因组通常由一条环状的双链DNA分子组成，在细胞中与蛋白质结合成染色体的形式，在细胞内形成一个致密的区域。 原核生物基因组的一般特点 基因组较小（106bp～107bp）
功能上相关的几个结构基因串联在一起组成操纵子(operon)结构。 结构基因均为单拷贝基因（除18s、28s、5s rRNA及tRNA基因外）
不编码的DNA序列约占全基因组的10%以内（比真核生物少得多）：基因组中几乎没有重复序列，基因间几乎没有间隔，基因内没有内含子（古细菌除外）。 不编码部分通常包含调控基因表达的序列
DNA分子中有各种功能区，如复制起始区OriC，复制终止区TerC，转录起始区和终止区等，这些区域往往有反向重复序列，能形成特殊的结构。
多顺反子：即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。
转座子：能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列称为转座因子（transposable element），又称为可转座元件。
插入序列(insertion sequence，IS) ：2 000bp以内，两端正向重复序列（direct repeats，DR）、反向重复序列（inverted repeats，IR），中间1kb左右的编码序列，仅编码和转座有关的转座酶。
复合型转座子( composite transposon) ：2 000～20 000bp之间，两端由一对IS元件组成，带有与转座作用有关的基因和其他基因。
质粒（plasmid）：是指一类染色体外具有自主复制能力的环状双链DNA分子，属染色体外基因组。
共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）没有游离的末端，每条链上的核苷酸通过共价键彼此头尾相连，这种结构称为,常形成超螺旋结构。
严紧控制（stringent control）型质粒：其复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝。
松弛控制（relaxed control）型质粒：其复制与宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。 质粒的稳定性：质粒在宿主细胞内稳定地存在而不丢失称为质粒地稳定性。
质粒的不相容性：两种不同的质粒因利用同一复制和维持机制，在复制和随后向子代细胞分配的过程中会发生竞争，从而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质粒将被丢失的现象。
原核生物基因组的一般特点？
1.基因组较小（106bp～107bp）。
2.操纵子结构是原核生物基因组的功能单位。
3.结构基因均为单拷贝基因（除18s、28s、5s rRNA及tRNA基因外）。
4.不编码的DNA序列约占全基因组的10%以内（比真核生物少得多）：基因组中几乎没有重复序列，基因间几乎没有间隔，基因内没有内含子（古细菌除外）。 5.不编码部分通常包含调控基因表达的序列
6.DNA分子中有各种功能区，如复制起始区OriC，复制终止区TerC，转录起始区和终止区等，这些区域往往有反向重复序列，能形成特殊的结构。
真核生物基因组的结构与功能特点
1.基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内， 除配子细胞外， 体细胞内基因组是双份的（即双倍体，diploid），有两份同源的基因组。
2.基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一条多肽链。 3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上。 4.基因组中不编码的区域多于编码的区域。
5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因，split gene）
6.基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起始点，而每个复制子的长度较小
rDNA：rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因组中，这样的区域称为rDNA，如染色体的核仁组织区（nucleolus organizer region）即为rDNA区。
反向重复序列 ：是指两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上的反向排列。
卫星DNA ：是另一类高度重复序列，这类重复序列的重复单位一般由2-10bp组成，成串排列。
DNA多态性：是指DNA序列发生变异从而导致的个体间核苷酸序列的差异，主要包括：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和串联重复序列多态性（tandem repeats polymorphism）
SNP：是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。SNP被认为是一种能稳定遗传的早期突变。
多基因家族（multi gene family）：是指由某一祖先基因经过复制和变异所产生的一组基因。
珠蛋白基因家族：家族的不同成员成簇地分布在不同染色体上，但核酸序列高度同源，编码一组功能上紧密相关的蛋白质。
假基因(pseudogene)：具有与功能基因相似的序列，但由于有许多突变以致失去了原有的功能，不能转录或转录后生成无功能的蛋白质的基因，常用ψ表示。
高等动物线粒体基因组具有独特的特点？
1.母系遗传。
2.线粒体DNA损伤后不易修复，突变率较高。 3.遗传密码与通用遗传密码存在差别。
遗传图谱（genetic map）：又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。
遗传多态性：在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1% 遗传学距离：在减数分裂中，两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM 物理图谱（physical map）：利用限制性内切酶将大分子DNA切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离〔碱基对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)〕为路标的图谱。 序列图谱：是分子水平上最高层次，最为详尽的物理图谱，可得到全部的DNA序列。
基因图谱（转录图谱）：在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。
基因定位克隆：是指利用微卫星和SNP全基因组扫描来搜索与疾病性状紧密相关的位点，从而确定疾病相关基因的位置并进一步获得克隆。
宏基因组：是指生境中全部微小生物遗传物质的总和。
宏基因组学：就是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和测序分析为研究手段,通过非培方法进行某个特殊生态环境中微生物群落的鉴定。
蛋白质组学(proteomics): 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。
双向凝胶电泳技术（2-DE）：2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等电聚焦电泳与第二向SDS-PAGE组成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白质等电点（pI）的差异进行分离，SDS-PAGE则是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离。
等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。
等电聚焦电泳: 利用具有pH梯度的支持介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
等点聚焦：就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上； 优点：有很高的分辨率
缺点：一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；
二是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。
2-DE原理
第一向电泳―IPG等电聚焦电泳在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的pH梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，带正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自的pI处时，所带净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上。这种不同的蛋白质分别聚集在各自的pI处，形成一条狭窄稳定的区带而彼此分开的现象称为等电点聚焦。
第二向电泳―SDS- PAGE 在PAGE系统中加入SDS和还原剂后所组成的电泳系统。SDS是一种阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质分子内，破坏蛋白质分子内的氢键及疏水作用，改变蛋白质分子的三级和四级结构；还原剂则断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质分子去折叠，结构变得舒展。蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子间原有电荷的差异。蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主要取决于蛋白质的分子量大小。
酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system)一种用于研究蛋白质相互作用的方法手段，它利用酵母细胞内的真核表达系统，将两种外源蛋白质的基因分别与酵母转录因子的两个功能结构域融合，通过质粒导入酵母细胞，以酵母细胞表型的改变作为外源蛋白是否发生相互作用的筛选标志。
基因工程（gene engineering ）：又称DNA重组技术（DNA recombination），是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。
分子克隆（molecular cloning ）：是指将目的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子大量拷贝的技术。
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。
回文结构（palindrome structure）：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。 粘性末端（sticky end）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。平末端（blunt end）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。 同工异源酶（isoschizomers）：指来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。
同尾酶（isocaudarner）：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶。
Taq DNA聚合酶（简称Taq 酶）：是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有→聚合酶活性和依赖于聚合作用的→外切酶活性。 逆转录酶（reverse transcriptase）：是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP），核糖核酸酶H活性（RNaseH），DNA聚合酶活性（DDDP）。
末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，简称末端转移酶）：分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的末端-OH上。
DNA连接酶（DNA ligase）：主要功能是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的磷酸基团与羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来。
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）：催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5-磷酸基团。 核酸酶S1：可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分。
载体（vector）：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。 克隆载体：能将外源DNA在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的DNA的载体。
克隆载体应具备的特征
1.能自我复制并具较高的拷贝数。 2.分子量一般
4.有适当的限制酶酶切位点，便于外源DNA的插入和筛选。
多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）：载体上具有的多个限制酶的单一酶切位点。 质粒：细菌染色体以外的小分子双链环状DNA，能自我复制并表达所携带的遗传信息。
质粒克隆载体的主要用途：
① 用于保存和扩增
② 构建cDNA文库。
③ 目的DNA的测序。
④ 作为核酸杂交时的探针来源。
溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌。
溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。 粘粒载体：由质粒和λ噬菌体的cos位点构建而成。
表达载体:是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。
报告基因：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因。 噬菌体载体的用途
1.用作一般的克隆载体。
2.用于构建基因组或cDNA文库（ 粘粒载体组成：
1.质粒复制的起始位点(Ori)。 2.携带抗药基因。
3.用于插入目的基因的单一酶切位点。 4.噬菌体的cos位点。
真核基因在原核细胞中表达需要保证外源基因：
1.插入方向的正确性； 2.受原核启动子的控制；
3.必须能在原核细胞中有效转录和有效翻译。
终止子：一个基因的末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能。
原核细胞表达载体的类型
1.非融合型表达载体：产生外源蛋白，易被原核细胞蛋白酶降解。如pKK223-3质粒载体。
2.分泌型表达载体：产生带信号肽的分泌型融合蛋白，可减少外源蛋白被降解以及使蛋白质能在细胞外正确折叠，易提取。如PINlll系列。
3.融合型表达载体：产生由较短的原核细胞多肽和真核细胞蛋白质构成的融合蛋白，具有抗原性，较天然的外源蛋白稳定。如pGEX系列。
基因工程的基本步骤
1.目的基因的获取 2.载体的选择
3.目的基因和载体的连接 4.重组DNA导入受体细胞 5.重组体的筛选和鉴定
目的基因的获取
1．从基因文库中获取 2.逆转录合成cDNA 3．人工合成DNA片段
4．直接从染色体DNA中分离目的基因
目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表达的基因。
基因组文库（genomic library，G-文库）：是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。 转化（transformation）：是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
感受态细胞(competent cell)：细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞。 重组体的筛选
① 根据载体的抗药性标志筛选
1.根据载体抗药性标志插入失活选择
2.-半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选法） 3.根据插入的外源性基因的性状进行筛选 4.核酸杂交技术筛选
蓝白斑筛选：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸-肽的DNA片段，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内-互补，形成完整的-半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal 形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。当外源基因插入lacZ基因中MCS，lac -肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落。
重组体的鉴定
1.2.3.4.根据重组子大小鉴定 酶切鉴定 PCR鉴定
DNA序列分析鉴定
核酸变性：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。
增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。
解链曲线：如果DNA是热变性而导致增色效应，以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。
融解温度（ melting temperature，Tm）：在热变性过程中，紫外吸收增加达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度。
Tm的影响因素
1.DNA分子大小和碱基的组成 2.溶液的离子强度 3.pH值 4.变性剂
复性（renaturation）：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。
退火（annealing）：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。
核酸复性的影响因素
1.温度和时间 2.DNA浓度
3.DNA分子大小和复杂度 4.离子强度
核酸分子杂交（molecular hybridization）:两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。
核酸探针（nucleic acid probe)：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。
选择探针的基本原则
1 .高度特异性
2.探针的来源是否方便 3.制备探针的难易程度
核酸探针的类型
1.基因组DNA探针 2.cDNA探针 3.RNA探针 4.寡核苷酸探针
cDNA(complementary DNA)：是指与mRNA互补的DNA分子。
固相分子杂交：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。
正向斑点杂交：简称斑点杂交，将待检样品（DNA、RNA 或细胞）直接点到膜上，烘烤固定。
反向斑点杂交：将不同的探针分别点到尼龙膜等固相介质上，再将已标记的待测DNA样本与之杂交，经洗涤去除未结合的DNA样本。
寡核苷酸探针设计原则
① 探针长度：一般要求在10～50bp。
②
G／C含量为40％～60％。
③
探针分子中应避免互补序列。
④
避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或 -CCCC-。
⑤
借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较。
理想的探针标记物应具有以下特点：
① 检测物要灵敏、特异、稳定、简便。 ② 标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂 交特异性、稳定性和Tm值。 ③ 标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。 ④ 标记物对检测方法无干扰。
分子杂交技术一般流程
1.探针制备及标记（同位素或非同位素）
2.待测核酸样品制备（分离，纯化） 3.杂交（液相，固相，原位杂交） 4.杂交后处理（去掉非特异杂交分子） 5.显示结果（显色，发光，放射自显影） 6.结果分析
Northern印迹杂交与Southern印迹杂交的不同点 ① RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染。 ② 所用器材最好与Southern印迹实验分开使用。 ③ RNA变性的方法：变性剂为甲醛或聚乙二醛，不能用碱变性。
④ 印迹前将含变性剂的凝胶用水冲洗掉， 再印迹、杂交。 ⑤ 如果测定RNA片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。 ⑥ 转印后不能用低盐缓冲液洗膜。
正向斑点杂交：简称斑点杂交，将待检样品（DNA、RNA 或细胞）直接点到膜上，烘烤固定。
反向斑点杂交：将不同的探针分别点到尼龙膜等固相介质上，再将已标记的待测DNA样本与之杂交，经洗涤去除未结合的DNA样本。
菌落杂交：将细菌从培养平板转移到硝酸纤维滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释放出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
夹心杂交法：设计两条能与目的基因序列互补但又不重叠的探针，一个称为捕获探针，另一个称为检测探针，目的基因被夹在两个探针之间。
微板酶联杂交的优点
① 捕获探针共价结合在微孔板上，不仅结合牢固而且结合量大，因而捕获能力很强。 ② 捕获探针竖直地而不是平躺地“包被”在微孔板表面，因而与目的片段的杂交效率很高。 ③ 检测探针5’端、3’端均标记生物素，等量检测探针结合亲合素-辣根过氧化物酶的量增加。
原位杂交（In situ hybridization ）：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。
原位杂交的应用
① 正常或异常染色体的基因定位。 ② 应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交用于检测该组织细胞中特定基因表达水平。 ③ 应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以检测有无该病原体的感染等。
原位杂交基本流程
1.细胞或组织切片的处理：玻片清洗、组织和细胞的固定 2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 3.预杂交 4.杂交
5.杂交后漂洗 6.结果检测
荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization, FISH）：是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。
基因芯片(gene chip)：又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray），是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纤维膜等载体。
杂交条件优化
1、探针的选择 ① 检测单个碱基改变选用寡核苷酸探针。 ② 检测单链靶序列选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针。 ③ 长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体。 ④ 100bp左右的探针适合原位杂交。 2.探针的标记方法
①在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。
②在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和价廉的HRP显示系统等 。
3、探针的浓度
①随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。
② 膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml。
③原位杂交中，一般各种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml 。
4、杂交最适温度 ① 若反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。 ② 一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在65℃进行，当含50%甲酰胺时，在42℃进行。
5、反应时间和洗膜温度 ① 杂交时间短了，反应无法完成；长了引起非特异结合增多。一般杂交20 h左右。 ② 杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm值5~12℃进行 。
基因芯片的应用
1.基因表达水平的检测
2.基因突变和多态性的检测
3.基因芯片在药物筛选中的应用 4.预防医学领域的应用
5.基因芯片在疾病诊断中的应用：感染性疾病诊断、遗传性疾病的诊断
基因诊断：分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学技术，直接检测遗传物质结构和表达是否异常，从而对疾病做出判断的方法。 基因诊断特点：
1.灵敏度高，特异性强。 2.可以进行病因诊断。
3.病原体诊断时所耗时间短，同时可以检查成百上千个病原体 4.在症状出现前作出前瞻性诊断。 遗传性疾病的基因诊断策略 1.直接诊断策略 2.间接诊断策略
感染性疾病的基因诊断策略 1.一般性检出策略 2.完整检出策略 肿瘤的基因诊断策略 1.检测肿瘤相关基因 2.检测肿瘤相关病毒基因 3.检测肿瘤标志物 4.表观遗传学检测
基因治疗（ Gene therapy ）：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。
广义概念，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。 基因治疗的必备条件： 1.分子缺陷清楚
2.可以得到相应基因的克隆 3.病理生理机制已知 4.有利的风险-利益比 5.治疗基因可以被调控 6.合适的靶细胞 7.有效安全 8.相关法规健全 基因治疗的总体策略 针对致病基因：
（1）基因矫正（gene correction）
对于致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能；
（2）基因置换（gene replacement）
用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；
（3）基因增补（gene augmentation）
将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除；
（4）基因表达调节（modulation ）
指将特定的反义核酸、RNA干扰或核酶等技术抑制目的基因表达从而消除致病基因的作用。 针对非致病基因： （1）自杀基因
这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药
物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。
（2）免疫基因治疗
将某些细胞因子（IL-
2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。
（3）耐药基因治疗
在肿瘤化疗过程中， 把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。
基因治疗的基本程序
1.目的基因的选择和获取
2.目的基因与转运载体结合 3.靶细胞的确认
4.载体携带外源基因进入细胞 5.外源基因的整合
6.外源基因的表达及检测
7. 治疗作用及稳定性、安全性评价 逆转录病毒载体的特点
（1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；
（2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞； （3）感染靶细胞后不扩散；
（4）假病毒感染靶细胞的效率非常高； （5）不感染非增殖细胞。 缺点:
①容量小，只能容纳8kb-10kb的外源基因片段；
②血清补体能使之失活；
③病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度；
④病毒整合到DNA后，可能引起插入突变和激活癌基因的可能；
⑤宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用上有一定局限性。 腺病毒载体特点 （1）宿主范围广
（2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件 （3）可获得高病毒效价 （4）重组体非常稳定 （5）不会引起肿瘤 （6）有较高的安全性
（7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用 （8）不整合入染色体 痘苗病毒载体
优点：
1.宿主范围广泛且易于培养，容易获得高滴度的病毒颗粒。
2.允许在同一或不同非必需区插入多个基因，以表达多种或一种外源蛋白。 缺点：细胞毒性；病毒能被人体的补体系统灭活并降解
单纯疱疹病毒载体 特点
（1）滴度高 （2）容量大
（3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染 （4）不整合，但可长期存在并可稳定表达
脂质体载体：是用人造双层磷脂质，包装DNA 后形成的脂质体-DNA复合物。
优点：（1）无毒无抗原性；（2）目的基因与脂质体的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大；（3）可单独或联合其他载体使用，并可通过静脉注射使目的基因进入特定部位。
缺点：表达时间短，不能通过细胞膜屏障
分子耦联载体：由DNA、DNA结合因子和配体三部分组成。配体与特异的受体结合，经受体介导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内。
多聚物载体：利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷的DNA相结合，形成稳定的多聚复合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。
纳米微生物优点：
(1)纳米脂质体主要由磷脂以及胆固醇合成，可以通过与细胞膜的融合或者胞吞作用将目的基因导入靶细胞；
(2)纳米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在传递过程中无毒，无免疫原性，并且可以通过新陈代谢降解，因此不会对细胞产生毒性；
(3)通过调节纳米材料的降解速度，还可以控制目的基因的释放速度，延长其治疗效果；
(4)纳米基因载体比表面积大，并可在表面偶联靶细胞的配体或抗体，实现基因治疗的主动靶向性，大大提高基因传递的特异性和加强靶细胞对目的基因的摄取。
靶细胞的选择原则：
（1）必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内；
（2）具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，最后可延续至病人的整个生命期； （3）易于受外源遗传物质的转化；
（4）在选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞 。 干细胞:一种具有复制能力、可以形成各种组织的早期未分化细胞 进行基因治疗必须具备下列条件：
（1）选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚； （2）纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件； （3）该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；
（4）具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。
靶向性基因载体的选择：
1.靶向特异性，并且可被免疫系统识别。 2.高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化。 3.安全，无毒性，对人体以及环境无危害。 4.有利于基因高效转移和长期表达。
反义技术：是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段，使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的。
RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。
小干扰性RNA（siRNA）：长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA）。
RISC ：RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,)，siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RISC。该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。 基因治疗存在的问题：
1.导入基因的稳定高效表达；选择合适的转移方法；选择适当的受体细胞。 2.导入基因的安全性；一方面应构建相对安全的反转录病毒载体；另一方面，应寻找更安全的非病毒载体；体细胞基因治疗。
3.基因治疗与社会伦理道德 。 基因治疗应满足的条件
1、单基因缺陷疾病
2、仅限体细胞的基因治疗
3、靶细胞易获取、培养、及回输体内。
4、治疗效果应胜过对病人的危害。
5、表达水平无需调控且无副作用。
6、需经动物实验验证安全可行。 基因治疗有待解决的问题
1、难以获得真正有治疗作用的基因。
2、外源基因的表达难以在体内精确调控。
3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变。
4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响。
5、随机整合潜在的威胁。
生物分子（Biomolecule）：泛指生物体特有的各类分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。
生物大分子：生物体内结构具有一定规律性，由基本结构单位按一定顺序和方式连接而形成的多聚体。主要是指蛋白质、核酸和糖复合物，是生命活动的物质基础。 提取：在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于适当的溶液中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶液中，最大限度分离出来的过程。
根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型：
（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等； （2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；
（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；
（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。 （5）根据配体特异性，如亲和层析。 影响提取效果的因素
1.2.3.4.5.6.PH值 盐浓度 温度 水解酶 搅拌与氧化 有机溶剂
盐溶：蛋白质或酶在稀盐溶液中，溶解质随着盐浓度升高而增加。
盐析：蛋白质或酶在稀盐溶液中，溶解质随着盐浓度升高而增加。但当盐浓度达到一定数值时，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。
选择性沉淀法：生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白变性沉淀而得到分离提纯。 超滤：指在一定压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到部分纯化。
对于核酸的纯化应达到以下三点要求：
（1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂；
（2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度； （3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。
保持核酸的完整性
（1）温度不要过高(0～4℃)；(高温破坏氢键) （2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破坏磷酸二酯键) （3）保持一定离子强度;
（4）减少物理因素对核酸的机械剪切力。
DNA提取，DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原因：
1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质
2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 3.DNA中残留有金属离子 对策：
1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前） 2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）
DNA降解
原因：
1.材料不新鲜或反复冻融
2.未很好抑制内源核酸酶的活性
3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 4.外源核酸酶污染 5.反复冻融 对策：
1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融
2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液
3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔
5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融
DNA提取量少
原因： 1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤时DNA丢失 对策：
1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料
2.动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 4.低温沉淀，延长沉淀时间 5.加辅助物，促进沉淀
6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒 蛋白质分离纯化的总体原则 一是保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白质的变性； 二是尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求。 蛋白分离纯化影响因素： 1.缓冲液2.盐、金属离子和螯合剂3.还原剂 4.去垢剂5.增溶剂 6.蛋白酶抑制剂7.蛋白质的环境因素：表面效应的影响；温度的影响；保存的方式。
蛋白质的纯度：指是否含有其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内，及在一定条件下的相对均一性。
凝胶过滤层析：亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。
电泳：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳。
亲和层析：是以蛋白质与结合在介质上的配基间的特异亲和力为工作基础的蛋白质分离方法。
纯化程度：常用某一特定靶蛋白成分的含量（一般用活力单位）与总蛋白量（质量单位）之比来表示。 蛋白质的分离纯化方法：
1.以溶解度的差异为依据的方法：盐析、分配层析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀和结晶等； 2.以分子大小及形状差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤层析等； 3.以电离性质差异为依据的方法：电泳、离子交换层析等； 4.以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析。 生物小分子提取方法：
1、溶剂提取法
2、水蒸气蒸馏法
3、升华法
4、超临界流体萃取法
5、超声提取法
6、固相萃取法
分离精制的原理主要是根据： 1.物质溶解度差别；
2.物质在两相溶剂中的分配比不同； 3 .物质的吸附性差别；
4.物质分子大小差异等进行分离 生物小分子纯化方法 液-液萃取法
1、逆流分配法（CCD）
2、液滴逆流色谱法（DCCC）
3、高速逆流色谱法（HSCCC）
4、气液分配色谱（GC或GLC） 沉淀法
1.溶剂沉淀法 2.酸碱沉淀法 3.盐析法 了解
超临界流体：(SF)指某种气体（液体）或气体（液体）混合物在操作压力和温度均高于临界点时，使其密度接近液体，而其扩散系数和黏度均接近气体，是性质介于气体和液体之间的流体。
超临界流体萃取法（SFE）:利用超临界流体为溶剂，从固体或液体中萃取出某些有效组分，并进行分离的一种技术。 超生提取法：利用超声波特殊的强纵向振动、空化效应、高速冲击破碎、搅拌及加热等物理性能，破坏提取物细胞结构，使溶剂能渗入细胞内部，从而加速有效成分的溶解，提高有效成分的提出率。
固相萃取法：利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。 PCR特点：
1.灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平；能从100万个细胞中检出一个靶细胞；病毒检测的灵敏度可达3个 PFU (空斑形成单位)；细菌检测的最小检出率为3个细菌
2.简便、快速
一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增；扩增产物一般用电泳分析 3.对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA平台效应:DNA的指数扩增并不能无限期地进行下去，PCR循环后期时由于引物、dNTP消耗、DNA聚合酶活力下降等因素使地扩增产物累积趋于饱和，原来以指数递增的速率曲线变成平坦的曲线，此现象称为平台效应。
引物设计基本原则
1.引物长度，典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内引物需要足够长，最多不超过50个核苷酸。
2.PCR产物长度，扩增片段长度在普通PCR以200～500bp为宜；实时荧光PCR则为50～150bp。 3.引物的均衡性和GC含量，同一碱基连续出现不应超过5个，G-C含量一般为40-60%。
4.引物溶解温度（Tm值），引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.
聚丙烯酰胺凝胶电泳特点
1.分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开； 2.上样量远大于琼脂糖凝胶； 3.回收的DNA纯度高；
4.采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。 PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）：根据目的基因序列可查出所包含的酶切位点，用相应的限制性核酸内切酶消化PCR扩增产物，然后进行电泳，观察消化片段的大小是否与序列资料相符，从而确定产物的特异性。 单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）：将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （DNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与DNA序列有关。因此，电泳结束后，DNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。 PCR常见问题
一、假阳性
1.PCR产物是最主要的污染源。 2.阳性对照的污染。
3.标本之间的交叉污染。
4.在采集标本时，其他污染源带来的污染。 5.用带有污染的试剂。
二、假阴性
1.标本处理的原因
（1）处理标本时，靶DNA丢失。
（2）理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。 （3）标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）
2.PCR试剂问题。
（1）引物设计不合理。 （2） Taq DNA聚合酶失活。
（3）Mg2+浓度过低或是没有加。 3.PCR扩增过程中的问题
（1）PCR扩增仪故障。
（2）PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。
4.PCR产物鉴定中的问题
（1）电泳时没有加溴化乙锭。
（2）电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。 （3）胶浓度过低，使扩增带跑散。
三、引物二聚体
形成引物二聚体的原因有：
⑴两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3′端有互补区。
⑵引物比例太高，可增加模板用量。
⑶退火温度过低。
⑷热循环次数过多。
四、非特异性PCR产物
（1）引物特异性不高或用量太大，应更换引物或降低用量；
（2）TaqDNA聚合酶质量不好或用量太大，应更换酶或降低酶使用量； （3）Mg2+浓度过高，可适当调整其浓度； （4）退火温度过低，可提高退火温度； （5）延伸时间过长，可减少延伸时间；
（6）循环次数过多，应适当增加模板量，减少循环次数。
one-step RT-PCR：一步法RT-PCR，在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA为模板进行逆转录和PCR扩增。 多重PCR（multiplex PCR）：在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。
重组PCR（recombinant PCR）：将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。该技术主要应用于DNA片段的任何位置引入点突变、插入、缺失以及两个不相邻片段的连接。
巢式PCR：用两队引物，一对引物序列在模板的外侧，另一对引物在模板的内侧。第一对引物做PCR的扩增产物作为第二对引物退火的模板，再做PCR。经过两次PCR放大，灵敏度得以提高，并大大提高PCR的特异性。 锚定PCR（anchored PCR，APCR）：用于扩增已知一端序列的目的DNA。
定量PCR:以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。
实时荧光定量PCR（RT-FQ-PCR）：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数
荧光定量PCR的临床应用
1.遗传疾病的早期诊断 2.肿瘤的诊断
3.抗病毒药物疗效的观察、指导 4.病情评估和预后判断 5.新药验证 6.输血源的筛选
7.母婴传播的控制与观察
PCR操作程序标准化
（一）上岗人员培训制度
（二）标准化PCR诊断实验室
（三）PCR标准化操作程序 1．试剂配制、分装及保存 2．标本的采集与处理
3．基因扩增及其实验条件的选择 4．扩增产物检测 5．PCR结果的判读
（四）污染的预防及污染源的标准化处理
代谢组(metabolome)是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合, 包含一系列不同化学型的分子, 比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。
代谢组学(metabonomics／metabolomics) 通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。
代谢组学特点：
1.关注于内源性小分子化合物。
2.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究
3.内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。 4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。 应用： 1.药物研发 2.疾病研究 3.植物代谢组学 4.微生物代谢组学 5.中药现代化
毛细管电泳-质谱联用技术（CE-MS）：毛细管电泳是以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。适用于普通反相色谱柱不易保留的离子性代谢物的分离分析。
miRNA：miRNA是由21~25个核苷酸组成的非编码RNA；它通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达；它在生物体生长发育、细胞增殖、分化、凋亡以及人类各种疾病的发生发展过程中发挥重要的调控作用。
MicroRNA的起源与生物合成过程
1.miRNA基因被转录成pri-miRNA (RNA 聚合酶Ⅱ)；
2.pri-miRNA被剪切成具有70-100个核苷 酸 的pre-miRNA (Drosha,DGCR8)； 3.pre-miRNA从核内被转移至胞质 (Exportin-5, Ran-GTP)；
4.pre-miRNA被剪切成21-25个核苷酸的双链 RNA双体 (Dicer,TRBP,PACT)； 5.双链RNA双体中成熟miRNA链会选择性整合入RISC,并与mRNA互补配对。
MicroRNA的特征
1.广泛存在于真核生物中, 是一类内源性表达的非编码短序列RNA, 本身不具有开放阅读框 (ORF) ； 2.成熟的miRNA长度通常为21～25nt； 3.miRNA在进化上具有高度保守性；
4.miRNA表达具有细胞和组织特异性，同时具有时序性
MicroRNA的调控机制
一、mRNA剪切 1.miRNA与靶mRNA几乎完全互补；
2.切割位点在从5‘端起与miRNA配对的第10位和11位核苷酸之间 ； 3.由RISC中的内切酶催化完成； 4.可催化多个mRNA分子的降解
二、翻译抑制
1.miRNA与靶mRNA互补程度较低；
2.翻译抑制可能发生在翻译起始后的某一阶段； 3.翻译顺利进行但翻译产物可能被特异性降解
MicroRNA表达的研究方法
1.miRNA基因芯片技术
2.PAGE/Northern blotting杂交法 3.原位杂交
4.miRNA实时定量PCR
MicroRNA功能研究方法
一、miRNA体外或体内水平的过表达研究 1.构建相应的表达载体
2.体外合成miRNA前体分子
二、miRNA表达抑制研究 3.基因水平抑制miRNA表达
4.使用反义核酸分子抑制miRNA表达
miRNA研究的实验技术
1.miRNA基因的克隆
2.PAGE/Northern blotting 3.miRNA基因芯片技术 4.miRNA实时定量PCR
miRNA基因克隆的基本步骤
（一）总RNA的提取
关键：尽量不使小RNA丢失
（二）小分子RNA分离纯化及富集
变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）方法是用于小分子RNA分离纯化的理想方法。
（三）小分子RNA片段修饰
小分子RNA的修饰包括磷酸化、去磷酸化以及在3‘端和5’端连接上连接子等
（四）克隆及测序鉴定
含3‘与5’端接头的小分子RNA，经RT-PCR扩增后连接至合适的载体，转化克隆，最后用相关方法鉴定阳性克隆。
（五）PAGE/Northern blotting验证
PAGE/Northern blotting方法是确认microRNA 最有效 和常用的方法。
PAGE/Northern blotting基本操作步骤
（一）总RNA的提取
关键：尽量不使小RNA丢失
（二）样品处理
取适量提取的RNA样品于上样缓冲液及去离子甲酰胺中 混匀，55℃孵育30 min，冰浴后准备PAGE分离。
（三）PAGE分离、转膜及固定
（四）寡核苷酸探针的制备 探针标记可选择放射性核素或非放射性荧光，其中放射 性核素敏感度高，可检测较低丰度的microRNA分子
（五）杂交、洗膜、压片及显影
（六）如果选用放射性标记的探针，在分析结果后要去除Northern印记膜上的放射性，避免放射性污染。
MicroRNA基因芯片技术主要应用：
（1）寻找和发现新microRNA基因；
（2）miRNA相关疾病的诊断和治疗，如肿瘤、白血病、糖尿病等；
（3）药物筛选和药物开发等；
MicroRNA基因芯片技术操作流程
（一）MicroRNA基因芯片的设计与制作
（二）RNA提取与纯化
（三）RNA样品的标记
（四）芯片杂交及后处理
（五）图像采集和数据分析
（六）验证
MicroRNA实时定量PCR主要应用：
（1）microRNA的定量检测，可精确检测出细胞或组织样品中特定微量的microRNA表达水平；
（2）由于该方法可以同时检测microRNA及其前体，因此，可以根据两者在不同发育阶段的表达差异情况来深入了解microRNA的起源和发生； （3）应用于临床诊断和治疗等。
MicroRNA实时定量PCR操作步骤
（一）总RNA提取、小分子RNA的分离纯化及富集
（二）逆转录反应
（三）实时定量PCR MicroRNA造成疾病发生的可能原因：突变、基因表达失活、低效转录等原因造成的microRNA表达下调；启动子区域基因扩增或突变等原因造成的microRNA表达上调等。 MicroRNA引发肿瘤的可能原因：
（1）microRNA与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，而肿瘤则是由细胞增殖、分化、凋亡功能紊乱而引发的 ； （2）许多microRNA的基因位于基因组中易发生断裂、移位、缺失等变异的区域 ； （3）与正常组织相比，在恶性肿瘤和肿瘤细胞株中普遍存在着对microRNA的表达失控 MicroRNA引发糖尿病的可能原因：
（1） MicroRNA参与胰岛素的合成分泌调节； （2） MicroRNA对血糖代谢起着直接或间接的调控作用； （3）MicroRNA与脂质代谢密切相关； 附作业一
1.断裂基因: 基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，一个基因不仅仅包括编码蛋白质或 RNA 的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列、位于编码区 5 ' 端与 3 ' 端的非编码序列和内含子。真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene）。
2.单核苷酸多态性：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。 1.简述真核生物基因组的结构与功能特点。 答：（1）真核生物细胞核基因组的结构和功能。
①：真核生物基因组存在大量的重复序列 a) 单拷贝序列（低度重复序列） b) 中度重复序列 c) 高度重复序列
d) 重复序列的多态性：主要包括单核苷酸多态性和串联重复序列多态性 ②：真核基因组存在多基因家族和假基因
多基因家族：是指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。
假基因：是指与某些有功能基因结构相似，但不能表达有功能基因产物的某些基因。 （2）真核生物细胞器基因组的结构和功能
真核生物有两类细胞器能携带遗传物质：线粒体和叶绿体
大多数细胞器基因组是环状DNA，某些低等真核生物（如草履虫、衣滴虫和几种酵母）的线粒体DNA是线状分子。线粒体基因组的大小差异比较大，从1万至数百万bp不等。高等动物线粒体基因组具有独特的特点：母系遗传；线粒体DNA损伤后不易修复，突变率高，可能与衰老及某些疾病有关；遗传密码与通用遗传密码存在差别。 2.试述双向凝胶电泳技术的基本原理。
答：蛋白质组研究的发展以双向电泳技术（2-DE）作为核心。原理简明：是利用蛋白质的带点性和分子量大小的差异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质的技术。第一向电泳是依据蛋白质的等电点不同，通过等电聚焦电泳（isoelec-tricfocusing，IEF）将不同净电荷的蛋白质在PH梯度介质中外加电场作用形成分离的蛋白质区带。然后将凝胶包埋在SDS-PAGE凝胶板上端，根据蛋白质分子量的不同，在垂直或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），即第二向电泳。在IEF中，蛋白质因等电点不同而被分离，在SDS-PAGE中，不同分子量的蛋白质相互间被分离开。 作业二
1.分子克隆技术包括哪些基本步骤？
答：分子克隆技术的基本步骤大致包括：①目的基因的获取；②载体的选择；③目的基因与载体连接；④重组DNA导入受体细胞；⑤重组体的筛选等；即分、切、接、转、筛等过程。 2.目的基因和载体连接主要有哪些方法？
答: 目的基因与载体构建成重组体的方法主要有：1).粘性末端DNA分子的连接2).平末端连接法3).通过同聚尾连接。
3.简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。
在分子克隆技术中，常用的工具酶主要有：1.限制性核酸内切酶，它是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶；2.DNA聚合酶Ⅰ，它具有3种酶活性：1)5'→3'聚合酶活性；2)3'→5'核酸外切酶活性；3)5'→3'核酸外切酶活性；3.反转录酶，其功能主要有：1)逆转录作用2)核酸酶H的水解作用3)依赖DNA的DNA聚合酶作用；4.DNA连接酶，它在DNA重组中的主要功能是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5'磷酸基团与3’羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组；5.碱性磷酸酶，它的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5'-磷酸基团；6.末端脱氧核糖核苷酰转移酶，其功能主要有：1)在载体或目的基因 3'末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。2)用于DNA 3'末端的同位素探针标记；7.核酸酶S1，其作用是除去双链DNA的粘性末端以产生平末端、除去cDNA合成时形成的发夹结构以及分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况等。 4.举例说明载体应具备的基本要素。
答: 载体应具备以下特征：1)能自我复制并具有较高的拷贝数，并有适宜的分子量，一般应
答：1.双抗生素筛选的原理是：因大多数质粒载体带有抗生素抗性标记的特征（如Ampr、Tetr等），当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。 2.蓝白斑筛选的原理：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸α-肽的DNA片段， IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内α-互补，形成完整的β-半乳糖苷酶。该酶能催化指示剂底物X-gal 形成蓝色菌落。当外源基因插入lacZ基因中MCS，lacα-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落。 6.有哪些常用的探针标记物？
答：常用的探针标记物有：1.放射性同位素标记，常用标记探针的同位素有 32P、3H、35S、131I、125I 等。2.非放射性标记，常用的非放射标记物有辣根过氧化物酶（HRP)、荧光素、生物素、光敏生物素、地高辛 (DIG) 等。
7.如何进行探针的标记？
答：1.放射性同位素标记探针的的方法有缺口平移法、随机引物法、末端标记法和反转录标记法等。2.非放射性标记核酸探针的方法分为化学修饰标记法和酶促反应标记法两大类： ① 化学修饰标记法是利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的某些基团发生化学反应，将标记物直接或间接结合到探针分子上。化学标记法具有方法简单、成本低、标记方法较通用，也是目前较为常用的标记方法； ② 酶促反应标记法是将标记物预先标记在单核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到核酸探针分子中。这种标记法具有灵敏度高的优点，但其标记过程较复杂、成本较高。
8.影响核酸分子杂交的因素有那些？如何进行杂交条件的优化？ 答：影响核酸分子杂交的因素有: 杂交方法的选择、探针的选择、探针的浓度、温度、杂交液的成分、反应时间等。 核酸分子杂交实验条件的优化有：
1.探针的选择：针对不同的杂交实验，选择不同的核酸探针，在大多数情况下，可以选择克隆的 DNA 或 cDNA 双链探针。但在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的 DNA 单链探针或 RNA 探针。
2.探针的标记方法，选择什么标记方法视灵敏度和显示方法等实验要求和条件而定。
3.探针的浓度：随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。 4.杂交最适温度，在实验前必须首先确定杂交温度。 5.杂交反应时间，一般杂交反应要进行 20 h 左右。
6.洗膜温度，杂交后的最终洗膜温度一般应低于 Tm 值 5~ 12 ℃ 进行。
7.杂交液的优化,通常用于 DNA 杂交的标准杂交液为 5×SSC, 1.0%casein , 0.1% 十二烷基肌氨酸， 0.02% 十二烷基硫酸钠。但除了以上成分外，必要的时候可以加一些杂交促进剂。常用的有硫酸葡聚糖，它能促进 DNA 链之间的缔合。 作业三
一、名解
1.生物大分子：指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。
2.酚抽提法：最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。
3.凝胶过滤层析：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。
4.巢式PCR ：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。 5.Real-time PCR：实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
6.变性：模板DNA经加热至94℃左右5min 聚合酶链式反应时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
7.复性 ：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
8.退火：温度突然降至37-58℃时，变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢键开始复性。一般退火温度比引物Tm值约低5℃。
1.根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？
答：根据作用原理生物分子的分离纯化可分为：（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。（5）根据配体特异性，如亲和层析。 2.什么原因易引起DNA降解，该如何解决？
答：引起DNA降解的原因有：1）材料不新鲜或反复冻融2）未很好抑制内源核酸酶的活性3）提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4）外源核酸酶污染5）反复冻融。
相应的解决方法有：1）尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液2）在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量3）细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔4）所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌5）将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。 3.简述PCR技术的基本原理及其反应体系的一般组成？
答：PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，是在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在反应中混合下列物质：模板DNA、四种dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、引物
1、引物
2、TaqDNA聚合酶、缓冲液及Mg2+（MgCl2），然后经下列过程大量扩增靶DNA。基本的反应分变性、退火、延伸等三步完成。
4.试分析PCR出现非特异性扩增产物的原因及解决方法？ 答：（1）引物特异性不高，引物用量过多，应调换引物或降低引物用量。（2）TaqDNA聚合酶质量不好或用量偏高，应降低酶量或使用质量较好的酶。（3）Mg2+浓度过高，可适当调节Mg2+浓度。（4）退火温度过低，退火及延伸时间偏长，可提高退火温度，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增。（5）热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数。 作业四
一、名解 1.代谢组学：通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。
2.毛细管电泳：毛细管电泳是以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。
3.NMR：基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学，主要用于反映化合物结构中的H和C原子的位置信息。
4.gene therapy：基因治疗将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。 5.stem cell：干细胞将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。
6.CRISPR/Cas system：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats aociated (Cas)）Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。基于细菌的这种免疫功能，人们把Ⅱ型CRISPR-Cas系统改造成一种全新的人工核酸内切酶，从而使该系统能够对靶基因进行修饰。
二、问答 1.简述代谢组学特点？
答：1.关注于内源性小分子化合物。
2.对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究
3.内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。 4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。 2.简述MicroRNA的生物合成过程？
答：1.miRNA基因被转录成pri-miRNA (RNA 聚合酶Ⅱ)；
2.pri-miRNA被剪切成具有70-100个核苷 酸 的pre-miRNA (Drosha,DGCR8)； 3.pre-miRNA从核内被转移至胞质 (Exportin-5, Ran-GTP)；
4.pre-miRNA被剪切成21-25个核苷酸的双链 RNA双体 (Dicer,TRBP,PACT)； 5.双链RNA双体中成熟miRNA链会选择性整合入RISC,并与mRNA互补配对。 3.简述miRNA功能研究方法？
答：1.miRNA体外或体内水平的过表达研究 1.1 构建相应的表达载体 1.2 体外合成miRNA前体分子 2.miRNA表达抑制研究
2.1 基因水平抑制miRNA表达
2.2 使用反义核酸分子抑制miRNA表达 4.MicroRNA引发肿瘤的可能原因？ 答：（1）microRNA与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，而肿瘤则是由细胞增殖、分化、凋亡功能紊乱而引发的 ；
（2）许多microRNA的基因位于基因组中易发生断裂、移位、缺失等变异的区域 ；
（3）与正常组织相比，在恶性肿瘤和肿瘤细胞株中普遍存在着对microRNA的表达失控 5.简述基因治疗的必备条件。
答：1）分子缺陷清楚2）可以得到相应基因的克隆3) 病理生理机制已知 4) 有利的风险-利益比 5) 治疗基因可以被调控 6) 合适的靶细胞 7) 有效安全 8) 相关法规健全。 6.简述骨髓干细胞的特性。
答：1）具有可移植性和自我更新能力，在体内永不耗竭，只需单次治疗；2）具有多能性，可分化为粒、红、淋巴和血小板等各种血细胞，且在分化过程中保持基因组的相对稳定，使目的基因随细胞的分化成熟而相对扩增，病人可终身受益；3）外源基因表达产物可通过血液循环遍布全身； 4）造血干/祖细胞的功能活性可在体内外进行分析；5）取材于自体骨髓或脐带血，易于获取也便于植回并存活，临床已有成熟技术。 7.简述基因治疗有待解决的问题。
答：1) 难以获得真正有治疗作用的基因 2) 外源基因的表达难以在体内精确调控 3) 体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变 4) 过多的外源蛋白对机体带来可能的影响 5) 随机整合潜在的威胁。
