实验三:神经干动作电位引导
一、实验目的
1.通过学习神经干动作电位细胞外引导记录方法，了解电生理实验的基本方法和基本仪器的使用。
2.观察神经干动作电位的波形、幅度、潜伏期，探讨其机制。
二、实验原理
各种可兴奋细胞处于兴奋状态时，都有一个共同的、最先出现的反应——动作电位，即细胞膜受刺激后在原有静息电位基础上发生的一次膜两次电位的快速倒转和复原。动作电位是细胞兴奋的标志，它只是在外加刺激达到一定强度时方可出现。该实验中神经干动作电位的引导采用的是细胞外记录，当冲动传来时，神经的兴奋部位对于静止部位来说呈负电位，两者之间出现的电位差可被摆放在神经纤维外的记录电极和参考电极引导出来，显示在荧光屏上。由于本实验所用的坐骨神经标本包括许多种类的神经纤维成分，其各自的兴奋阈值不同，传导速度各异，所引导到的动作电位为各峰电位之和，为复合动作电位，因而其幅值在一定范围之内随刺激强度增加而增大。
可兴奋细胞任何一个部位的膜受刺激产生动作电位后，该处已除极的膜电位和邻近仍处于安静极化状态的膜电位之间出现一电位差并引起局部电流，流动的结果是未兴奋部位的膜内电位升高，而膜外电位降低，膜除极达阈电位，邻近的膜也产生动作电位。动作电位同样依局部电流的形式沿神经纤维传导，其速度取决于神经纤维的直径、内阻、有髓或无髓等。坐骨神经为混合神经，通过测定该复合动作电位经过的距离和时间，即可计算出神经干兴奋传导的速度。
三、器材试剂
生物机能试验系统，蛙手术器械，神经标本屏蔽盒，任氏液
四、实验步骤
1.坐骨神经--腓神经标本制备：
①脑脊髓破坏同实验一。
②用粗剪刀沿脊柱正中至耻骨联合中央剪开使之成两半，浸入成有任氏液的烧杯中。取一只腿放于玻板上，在坐骨神经起始端的脊柱处用玻钩轻轻游离坐骨神经，用细线结扎，靠近脊柱端剪断。将神经分离至大腿根部，在坐骨神经沟内找到坐骨神经，并沿神经分离两侧骨骼肌，剪短沿途分支直到腘窝。坐骨神经在腘窝上方分成胫神经和腓神经，沿腓神经分离至足部，剪断。将制成的坐骨神经——腓神经标本至于任氏液中浸泡数分钟，备用。
2.仪器连接和调试：
①神经屏蔽盒的安装：一对刺激电极互相尽量靠近，两队记录电极尽可能分开，神经槽内的所有电极都需要用小刀刮亮除去锈蚀和氧化膜并使各电极处于同一水平，以免接触不良。用镊子夹住神经标本一端的结扎线，将标本至于电极上。其方向是标本的近中断接触刺激电极，远中端接触引导电极。
②连接：刺激电极与计算机程序控制刺激器的输出端连接；距离刺激电极近的一对记录电极与计算机一通道相连，距离刺激电极远的一对记录电极与另一通道相连；两队记录电极引导的生物电信号输入计算机电位通道接口，经程控生物放大器放大，A/D转换，计算机处理，显示器显示。
五、实验结果
增大两记录电极距离，在一定范围内第一相峰值逐渐升高，持续时间延长，第二相峰值逐渐减小，电位持续时间逐渐延长；记录两点间滴加麻药，动作电位的波形第一相峰值逐步加大，第二相逐渐变小，直至消失形成单相动作电位；利用顶点所测速度与起点法测量值不相等。
六、讨论心得
1.神经纤维的兴奋部位相对于未兴奋部位来说呈负电位，两点之间存在电位差，通过单极或双极电极的引导在记录系统上进行显示和分析。由于采用的是胞外记录的方法，因而在单极记录时，测得的动作电位实际上是组成神经干中的每根神经纤维兴奋后的超射值在神经干表面的叠加。即此动作电位是一复合波，其上升相、下降相及峰值不是相应的单一动作电位波形的去极化相、复极化相及峰电位。在双极记录时，测得的波形实际上是两个记录电极的电位差，与单一动作电位波形相差更大，这使问题的分析更加复杂。动物实验制作的坐骨神经腓肠肌标本中，神经干是由具有不同生理特性的不同种类神经纤维所组成，故复合动作电位记录的是复合波。然而，每种纤维兴奋后传导速度各不一样，波长也各不相等，加上引导方式不同，这也增加了我们分析复合双相动作电位的复杂性及带来传导速度测定的困难。
2.对于单根神经纤维，其兴奋后产生负波。对于某一点，负波的产生和终止不是突然的，而需要一定的时间才能达到最高点，故记录曲线的上升和下降都具有一定的斜率。神经干受刺激后，由于不同神经纤维兴奋产生了不同的负波，它们波长不等，传导速度也不相等，所以神经干复合波随着传导距离的延长而变化，我们用双电极记录到双相动作电位有以下特点：①第一相峰值总高于第二相；②第二相持续时间总大于第一相；③每相的上升支与下降支都不对称。我们可以引入“迁延效应”这一概念说明以上特点，即神经干兴奋后，有一综合波长（λ），当传导一定距离后，因各神经纤维传导速度不同，λ将拉长，即λ与传导距离有关。而以往在讨论分析神经干动作电位时往往忽视了记录两点的距离对双相动作电位的影响，因此，记录点的距离对波形的影响值得深入讨论。
3.根据“迁延效应”,当兴奋通过两电极间这段距离时，第一记录点神经纤维同步兴奋数目较多，因而记录到的动作电位第一相峰值较高。由于各纤维兴奋传导速度不同，第二记录点神经纤维同步兴奋数目较少，因此记录到的动作电位的第二相峰值较低但持续时间长。第一项实验正是证明此理论。从结果中可以看出：在距离增大初期（约2 cm）以双相电位的抵消作用为主，复合动作电位双相峰值增大。随着距离继续增大，抵消作用减弱，表现为“迁延效应”的现象，第二相峰值开始减小，电位持续时间延长。以往分析双相动作电位不对称原因时，认为两记录电极间刚好有神经纤维分支，因而出现不对称（第一相高于第二相）。也有人认为从神经干粗端到细端所含神经纤维数目减少导致兴奋性降低从而出现不对称。实际上，我们通过刺激神经干细端记录粗端仍可得到与第一项实验相同的结果。可见“迁延效应”是主要原因。
4.传统方法诱导单相动作电位时，多通过夹伤两记录点间的神经干以阻断其兴奋传导来实现。但是，这种不可逆的损伤操作破坏了标本活性，只能放到最后一步进行。我们尝试采用麻药阻滞的方法，利用兴奋性的可恢复性，还可再进行其他实验项目。从结果中也可以观察到当用麻药阻滞两记录点间的神经干兴奋传导时，随着麻药作用的发挥，发现第一相动作电位峰值逐步加大，第二相逐渐变小，直至消失，充分验证了我们所述双相动作电位的互相消长的理论。
5.在传导速度测定的实验中，以往学生实验时只是简单的测出速度。我们通过对起点法和顶点法测定结果的比较，结合神经干的特性进行深入分析：动作电位的起点本质是神经干中传导速度最快的一类神经纤维传导兴奋到达记录点引起的，起点法测量的速度本质是此类神经纤维的传导速度。而顶点的形成本质是各种神经纤维兴奋相互叠加后最强的部分。如果采用顶点法测量，由于“迁延效应”代表的时间不够准确，不能代表神经干的传导速度，故应该采用起点法测量才更准确。
6.本实验既需要基础的理论知识，又需要对实验中的问题具体分析，从而达到对知识的灵活应用和深入扩展。相信学生在实验课上学习神经干动作电位时，若增加以上内容则能更好地理解神经干复合动作电位的原理，牢固掌握基本的电生理知识。
