1 微生物区系分析方法
分别在茯茶“发花”不同阶段取样，采用稀释涂布平板法，对样品中的微生物进行分离、纯化和计数。
1.1 分离培养基
细菌分离：
采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、蒸馏水lO00mL。将上述成分溶解定容，调pH7.2～7.4，分装，12l℃灭菌20min。倒平板前按50μg/ml的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用）。 酵母菌分离: 采用YPD培养基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏10g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH自然，113℃灭菌30min。。 霉菌分离：
采用PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤，定容至1000mL，添加20g葡萄糖和17-20g琼脂并定容至1000mL，121℃灭菌20min。等降温至55℃左右时，加入氨苄青霉素（或链霉素）50μg/ml(真菌分离计数时用以抑制细菌的生长)。或者加入氯霉素或庆大霉素灭菌之前加入。 放线菌分离：
采用高氏一号培养基：可溶性淀粉20g、氯化钠0.5g、硝酸钾lg、磷酸氢二钾 0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂18～20g、蒸馏水1000ml、pH7.2～7.4，121℃灭菌20min。可在盛无菌水的三角瓶中加10滴100g/l的石炭酸（苯酚）溶液和50μg/ml的制霉菌素以抑制细菌和霉菌的生长。
察氏培养基(1L)：葡萄糖30g；MgSO4·7H2O 0.5g；NaNO3 3.0g；KCl 0.5g；FeSO4·7H2O 0.01g；K2HPO4 1.0g；琼脂20g(观察霉菌形态用)，如要分离用需要灭菌后加30U/mL链霉素)。
其他鉴定用培养基成分及配方参照周德庆《微生物学实验手册》 1.2 计数方法
计数方法参照GB/T4789.2-2003《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》的测定方法 1.3 取样：每隔2天取一次样，每个样至少做1次重复，总共取7次样，为了减少误差，尽量取同一批样。尽量保证茯砖茶中微生物种类和数量不发生较大变化，样品取回后立即进行微生物分离计数。在取样时要测定发花环境（烘房）里的温度、湿度，取回样品后，要测定茶样的含水量和pH值。其余不做微生物分析的茶样应立即放在-20℃的冰箱里低温保存。
pH值的测定：准确称取2.00g茶样，加50ml蒸馏水，置于150ml三角瓶中，在振荡器上振荡浸提20分钟，过滤，滤液置于100毫升烧杯中，然后用通过标准pH溶液校正后的Backman电子酸度计，测定浸提液的pH值，每个试样重复两次。
1.4 分离、纯化茯砖茶中的微生物
菌种分离：以无菌操作分别称取试样25克，投入盛有玻璃珠及225ml灭菌生理盐水的500ml三角瓶内，振荡20min，用无菌移液管吸取1ml菌悬液，加到9ml的无菌水中，然后依次制成10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8等7个浓度梯度的菌悬液，用无菌移液管吸取1ml缓缓注入平板培养基内, 稀释涂布平板培养微生物, 密封置于28 ℃条件下培养, 4～5 d 后菌落长满整个平板。
菌种纯化：根据初分菌落的形态特征, 用接种针挑取各菌落的少量菌丝体, 接种在事先准备好的PDA 琼脂培养基上(每平板内接种3个菌落) ,进行划线平板培养，菌丝体生长1周后, 根据长出的各菌落特点进行筛选和纯化, 如此反复, 直至菌落的生长状态和形态特征均表现一致时视为单一菌种的菌落。
1.5 鉴定微生物的种类
借助菌落结构和显微镜观察初步判断微生物的种类，如要进一步鉴定，可通过微生物的生理生化反应和分子生物学深入鉴定。
2 微生物的分类检索鉴定方法
2.1 细菌鉴定
细菌鉴定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)、《一般细菌常用鉴定方法》、《常用细菌鉴定手册》作形态观察和相关的生理生化试验。 (1)形态观察：
个体形态观察：在显微镜下观察细胞形态、大小；
菌落形态观察：观察菌落形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度及培养基的颜色等。， (2)染色：革兰氏染色法、芽孢染色法等。 (3)生理生化及生态特征鉴定；
过氧化氢酶的测定、氧化酶的测定、好氧性测定、糖或醇类发酵试验、葡萄糖酸盐的氧化试验、V.P试验(乙酰甲基甲醇试验)、淀粉水解试验、明胶水解试验、硝酸盐还原试验、产生吲哚试验、H2S产生试验、石蕊牛奶试验、酪氨酸水解试验、精氨酸利用实验、柠檬酸盐或丙酸盐的利用试验、pH生长试验、生长温度的测定以及耐盐性试验等。 2.2 酵母菌鉴定
酵母菌鉴定参照《酵母菌的特征与鉴定手册》和《微生物学实验手册》对分离得到的酵母菌进行形态观察和相关的生理生化试验。 (1) 形态观察：
个体形态观察：无丝营养细胞的显微镜观察、掷孢子的形成和形态观察、子囊孢子的显微镜观察。 菌落形态观察。
（2）染色：美兰染色法。
（3）生理生化及生态特征鉴定：碳源同化试验、氮源同化试验、糖类发酵试验、产生类淀粉化合物的测定、在60﹪(w/w)葡萄糖-酵母膏中生长测试、在37℃下做生长温度的测定、脲酶试验等。 2.3 霉菌鉴定
参照《真菌的形态与分类》和《真菌鉴定手册》等相关文献，做相关的生理生化试验和形态观察。 形态观察包括：
（1） 菌落形态观察：颜色、大小、表明特征、质地等。 （2） 个体形态观察：菌丝、子实体、孢子的形态等。 2.3 放线菌鉴定
参照《放线菌鉴定手册》等相关文献，做相关的生理生化试验和形态观察。 参考文献
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