项目研究进展报告
一、项目研究进展
1、完成了酵母泥原料的预处理
啤酒经发酵后回收的酵母，含有麦芽壳、酒花沉淀与析出蛋白质沉淀等物质，同时在酿造过程中，由于一些酒花及代谢产物吸附在酵母上，酵母呈淡咖啡色，带有苦味与令人不愉快的酵母味，对成品有不良影响。因此，在提取之前，酵母泥必须先经过洗涤、除杂、脱苦等处理。将废弃啤酒酵母泥用蒸馏水进行淘洗离心，至离心上清液基本无色为止，经处理后，啤酒酵母呈乳白色，色泽好，无苦味用玻璃称量皿称取一定质量的淘洗干净的酵母泥置于恒温烤箱中70℃烘烤干燥至恒重，计算含水量。预处理工艺过程如下：啤酒废酵母→2-6℃水洗3-4次→沉淀酵母→加2倍体积5%酒石酸→离心→干净啤酒酵母。经处理后的啤酒酵母呈乳白色，色泽好，口尝无苦味。
2、采用不同方法酵母细胞壁的破壁
提取核酸的原理：酵母菌外层是厚达1.2μm的细胞壁，其化学成分是葡聚糖（30-40%）和甘露聚糖（30%），此外，脂类8.5-13.5%，蛋白质6-8%，还含有几丁质，酵母菌的葡聚糖，分子是为240000道尔顿，是一种分枝聚合物，葡聚糖与甘露糖之间由蛋白质维系起来。近10%的甘露聚糖的侧链通过磷酸二酯键与磷酸边接，所有这些连接方式都使得酵母提取物首要的也是关键的是如何破坏细胞壁。本研究采用浓盐法、溶胀法和稀碱法。浓盐法：用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞的通透性，使核酸从细胞内解放出来。食盐起到自溶促进剂，以及防腐与脱臭的作用。冷冻溶胀法：通过冷冻和加热引起细胞壁破坏的物理方法。它既不产生污染，又适合工业化生产。具体操作步骤是取适量啤酒酵母泥，投入预先搅动的等量沸水中，保持温度84℃，迅速加入液氮或碎冰，降温至25℃以下，啤酒酵母的细胞壁不能经受剧烈的迅速热胀冷缩而破碎，使细胞内的核酸游离出来。当温度降至25℃以下，在高倍显微镜下观察，90%以上的酵母细胞已破坏完全，能适用下一步核酸的提取分离。稀碱法：啤酒酵母的细胞壁主要由多糖组成，加入NaOH溶液溶解多糖以破坏细胞壁，增加通透性，使核酸从细胞内溶出。具体操作步骤是取啤酒酵母泥适量，加入8倍体积的1%NaOH溶液，于20℃以下反应1.5h，然后用6mol/L的HCL中和，核酸溶于水中。此方法中要注意碱的浓度和用量，8倍体积1%的氢氧化钠已足以使细胞壁大部分溶解，方便下一步的核酸提取，无需过浓和过量的碱，否则不仅为后面的中和、提取带来大的工作量，而且反应过强，会引起核蛋白严重水解变
性，影响提取效果。
3、啤酒废酵母中RNA的提取与测定
RNA提取的方法：预处理后的湿酵母泥→加水调成菌悬液→盐析→自来水冷却→离心分离（4000rpm，15min）→上清液→加盐酸调pH2.0-2.5→4℃冷沉过夜→RNA沉淀→pH2.0-2.5酒精洗涤两次→粗RNA。
RNA的测定方法（紫外分光法）：核酸类含有双键的物质在260 nm 处具有最大紫外吸收。把离心后的上清液稀释到合适的浓度， 测定其在260 nm 处的紫外吸收值，计算上清液中的核酸量。核酸含量(mg) =（A260／0.024）×上清
液体积×稀释倍数×10-3，其中0.024 是浓度为1μg/ mL 的RNA 溶液的OD值。
二、阶段性成果
1、完成了酵母泥中核酸提取工艺的研究，啤酒废酵母→蒸馏水洗2 次→沉淀酵母→加2 倍体积5 %酒石酸→离心水洗2 次→离心→干净啤酒酵母→沉淀→加水调成菌悬液→盐析→自来水冷却→离心分离（4000rpm，15min）→上清液→加盐酸调pH2.0-2.5→4℃冷沉过夜→RNA沉淀→
pH2.0-2.5酒精洗涤两次→粗RNA。
2、利用浓盐法从酵母提取RNA,最优工艺条件为：盐浓度为10%，提取时间为4小时，酵母浓度为10%，冷沉温度4℃，提取温度95℃，抽提液pH2至2.5，将RNA沉淀用pH2至2.5的乙醇洗涤。
三、存在问题
1、酵母泥细胞壁破壁的方法有很多：浓盐法、冷冻溶胀破碎、稀碱法、超声波破碎、和高压均质法，但本实验只是对浓盐法破壁进行了初步的探讨，应通过几种破壁方法比较以获得最佳的提取方案。
2、还需要通过正交实验确定RNA提取的最佳工艺参数。
3、还要考虑RNA提取的纯度问题。
SRP课程组成员：张雪培、刘红丽、蓝尉冰、胡明亮、赵鑫
二〇〇八年六月三十日
