园艺专业推广硕士《园艺植物生物技术》试题
一．名词解释
1．基因组：某一生物包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。 2．RT-PCR：一是反转录PCR的缩写，即通过聚合酶链式反应，将RNA链逆转录成互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。二是实时PCR的缩写，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 3．Northern blot：是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过Northern blot可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
4．AFLP：扩增片段长度多态性。是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。
5．蓝白斑筛选：蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，可用于菌落鉴定和筛选。
二．选择题
1.B 2.ABD 3.B 4.BD 5.A 6.BC 7.D 8.ABCD 9.ABC 10.BCD
三．简答题
1.简述植物农杆菌介导的植物遗传转化过程。
答：农杆菌介导的植物遗传转化是以农杆菌为媒介，将目的基因通过载体上的特定区域导入细胞，并整合到染色体中。主要过程为：①分离目的基因片段；②将目的片段链接到克隆载体上，形成重组DNA分子；③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞进行增殖；④从细胞中筛选重组子；⑤提取已经扩增的基因，进一步分析研究；⑥将目的基因克隆到表达载体，一般采用双元载体；⑦利用表达载体转化农杆菌；⑧利用农杆菌转化植株，常用的方法有原生质体法、真空渗入法和蘸花法3种。
2.列举基因工程中常用的工具酶。 答：基因工程中常用的工具酶有：
①限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。
②DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。 ③DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。
④逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。
⑤末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。 ⑥碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。 ⑦依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。 3.简述SSR标记原理和主要过程。
答：SSR即微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA。微卫星的突变率在不同物种、同一物种的不同位点和同一位点的不同等位基因间存在很大差异，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因而可以根据这两端的序列设计一对特意引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性。
主要过程：①反应体系，包括模板DNA、SSR引物、10×PCR缓冲液、dNTP、Tap 酶和ddH2O；②反应过程包括预变性、变性、退火、延伸，在PCR仪上进行；③将PCR产物在测序电泳仪上用5%聚丙烯酰胺凝胶分离，DNA染色采用银染法。④数据分析，可用Quantity One软件统计，再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。 4.简述改良CTAB法提取园艺植物DNA的原理及主要过程。
答：CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 主要过程：
① 称取植物组织约100-200mg，加适量液氮，研磨至组织破碎成粉末状，迅速转入2mL离心管。
② 在离心管中加入1mL 65℃预热的1.5×CTAB提取液 (100mmol/L的Tris-HCl，pH8.0，20mmol/L的EDTA，pH8.0，1.4mol/L的NaCl，4%的β-巯基乙醇)，放至65℃水浴30min，其间轻摇3次以混匀反应液。
③ 水浴后取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇( 24﹕1)混合液，轻轻上下颠倒混匀，室温下静置15min后，于10000 r/min离心3min，取上清液。
④ 将上清液移至新的离心管，加入0.7倍体积的冷冻异丙醇，颠倒混匀后放置15min，10000 r/min离心5min，弃上清液。
⑤ 用75%的乙醇清洗 3次，沉淀为白色透明状，用滤纸条吸干残留乙醇，在超净工作台上无菌风干后，将DNA溶于 50μL 超纯水中。 5.简述PCR反应中引物设计原理。 答：PCR反应中引物设计原理为：
①选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。
②长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15-25bp。
③Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致。若G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退货温度。 ④G+C含量：有效引物中的G+C含量一般为40%-60%。
⑤碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。
⑥引物末端：只有引物的3’端与模板结合，PCR才能进行，所以3’端最好是G或C。
⑦引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的结合，尤其避免3’端的互补。
⑧引物之间：上下游引物之间尽量少的存在互补序列，否则上下游引物退火结合，将影响到PCR的扩增效率。 6.简述同源序列法克隆目的基因的主要过程。
答：利用同源序列法快速克隆基因的基本思路是依据基因序列的高度保守区域，设计特异性的简并引物，通过PCR扩增基因组DNA或cDNA，获得所要分离的基因序列，多用于抗病基因的分离、克隆。主要过程为：①提取基因组DNA；②根据已知基因保守区域的核酸序列特征，运用软件设计引物并合成；③以基因组DNA为模板进行PCR扩增；④回收PCR扩增的目的片段；⑤将目的片段链接载体并转化大肠杆菌；⑥测序并进行序列分析。 四． 综合题
根据你所学，谈谈你对转基因植物的看法。
答：自1983年美国在世界上首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用。目前，转基因技术已经成熟，转基因作物已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。植物转基因技术主要应用于农业、生物和医学等领域，进行植物品种的改良、新品种的培育以及作为生物反应器生产生物药物和疫苗等。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术药品已应用到医药、保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃、进展最快的产业之一。因此，人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。
植物转基因技术的应用十分广泛：（1）植物品质改良、新品种的培育，以满足人类不断增长的物质生活需要：植物转基因技术可高效、快速提高粮食作物、蔬菜、林木树种和花卉草种的产量、品质和抗耐性，为培育高产、高抗、多抗、优质的新品种提供了科学的手段。（2）医药研究，为人类健康服务：转基因技术可以把植物作为“生物反应器”，进行药物蛋白、工业用酶、糖类、脂类等一些有益次生代谢产物的生产，具有成本低、周期短、效益高和安全性好的特点。（3）能源开发，促进世界经济的可持续发展：随着世界经济的发展，加速了对石油等有限的不可再生矿质能源的消耗，世界各国均面临着能源枯竭的严重问题。（4）减少环境污染，保护人类赖以生存的自然环境：转基因技术可以生产许多抗性强、适应性广的植物，最大限度地利用土地资源，增加全球植被的覆盖率，减少水土流失和土地沙漠化，减少因CO2增加引起的温室效应。抗病、抗虫转基因作物的广泛种植，可以减少农药的使用量。转基因植物可对土壤中的有毒污染物进行高效吸收或生物降解，通过植物修复系统使受污染的环境得到修复。
总之，转基因植物的广泛种植可以显著降低农业生产成本，提高农业生产效率；可以有效缓解人类的粮食问题、能源问题；可以大大提高人类的生活质量和健康水平；可以有效增加可利用的土地资源，扩大绿地植被面积，减少土地的沙漠化和盐碱化，减少环境污染，保护生态环境。目前，转基因技术及其转基因植物已广泛应用于农业、医药、食品工业、畜牧业等各个领域，其经济效益、生态效益和社会效益都是巨大的。植物转基因技术是一种技术创新，是现代科技革命的一个重要方面，在农业、生物、医学、食品、环保和能源领域具有广阔的发展前景。
