实验一 现代生物技术实验室与实验仪器
一、实验目的
实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代分子生物学实验室的规划与布局及常用仪器设备的主要功能的认识，掌握高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等关键仪器的使用方法。
二、实验场所选择及实验内容
园艺学院植物分子生物技术实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要相关仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭菌锅、接种至、培养室等；与分子生物学有关的高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、实验方法与步骤
1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。
2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局及功能分区情况；针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问。
四、实验注意事项
实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。
五、思考题
1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。
2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些？实验二 质粒DNA的提取、纯化及检测
一、实验目的
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取时最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例介绍质粒的抽提过程，应掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
二、实验原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
三、主要仪器及试材
含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液及离心机、移液枪、离心管及质粒DNA提取有关试剂。
液氮、及DNA提取有关试剂。
四、实验方法与步骤
（一）试剂配制:
1、LB培养基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，琼脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分装至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高压灭菌15min，室温贮存。
2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。
3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，过滤灭菌后-20℃保存。
4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。
5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配制。
7、溶液III:醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（视冰醋酸情况，也可按6:3:1配制），贮存于4℃。
8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
9、苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。
10、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。
11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
12、溴化乙锭（EB）：10mg/ml
13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装贮存于-20℃。
14、6×loading buffer（上样缓冲液）:0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
15、1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖与三角烧瓶中，加100ml 1×TBE，微波炉加热至完全熔化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5ug/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TBE），即可上样。
（二）实验步骤
1、取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LB固体培养基上划线37℃过夜培养。
2、用无菌牙签或枪头挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床-250r/min过夜培养。
3、吸取1.5ml菌液，12000g离心1min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净。
4、加入200ul预冷的溶液I，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底混匀沉淀或碎块）。
5、加入400ul新配置的溶液II，轻柔颠倒混匀（不可剧烈震荡），并将离心管置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
6、加入300ul预冷的溶液III，温和颠倒混匀，见白色絮状沉淀，置于冰上3-5min，使杂质充分沉淀（溶液III为中和液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀）。
7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇或2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，室温放置5min，4℃离心12000g ×15min。
8、倒尽上清，加75%乙醇浸洗沉淀除盐1-2次，4℃离心 10000g×10min，弃上清，将沉淀在室温或超净工作台上风干。
9、将沉淀溶于40ul 灭菌超纯水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存备用。
10、取制备的质粒DNA 1-2ul，加适当loading buffer混匀上样，1%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳1h进行检测。
五、实验注意事项
1、实验中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物质，操作时应注意防护，尽量减少台面污染。
2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。
3、质粒电泳检测一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。
六、思考题
简述质粒DAN提取的步骤。
实验三 PCR技术
一、实验目的
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。通过本实验应掌握PCR原理，学习PCR操作过程。
二、实验原理
PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在环境下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。
三、主要仪器及试材
含有外源cDNA片段的质粒或转基因苹果、番茄叶片总DNA；外源基因的特异引物及PCR仪与相关试剂。
四、实验方法与步骤
1、调整模板浓度至5ng/ul。
2、按下列体系配制反应混合液，混匀，离心5秒（注意加1滴矿物油覆盖PCR管）。
Template DNA
2ul（20ng） 10×buffer
2.0ul MgCl2（25mM）
1.5ul Primer F（10uM）
0.2ul Primer R（10uM）
0.2ul dNTPs（2mM）
2.0ul Taq（5U/ul）
0.2ul Add ddH2O to
20ul
3、PCR反应循环条件设置：
95℃
3min
1cycle 94℃
1min
55℃
1min 72℃
90s
35cycles 72℃
10min
1cycle 4℃
forever
4、检测：加2ul溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15ul反应产物点样电泳
5、在1%琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。
五、实验注意事项
1、引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；
2、PCR反应的各种成分不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作；
3、根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件；
4、注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。
六、思考题
简述PCR技术的原理和步骤。
