细胞核的分离与纯化
我们知道每一个细胞内部都是由多个结构组成的，比如说有细胞核，线粒体，内质网，高尔基体等，如果要研究细胞内这些部位的结构和功能，以及细胞器在细胞活动中所起的作用时，那么首先必须将其从生物材料中提取出来，进行分离纯化和测定之后，然后才能进行更深入的研究。我们今天就以小鼠的肝细胞核的提取为例，来了解一般分离提取的基本原理和方法。
通过本次实验，要求我们达到以下两个目的，1：掌握离心技术的原理和使用方法
2：掌握细胞核分离的原理和方法。那关于离心机的原理及使用方法我们在第一次实验课上已经讲过了，那么在这里我只强调两点，就是在使用的时候首先要注意配平原则并且规范操作，一定要注意安全，安全是第一的。那接下来我们就看一下细胞核的分离原理。
由于细胞内不同结构它的比重和大小是不同的，在同一离心场内的沉降速度也是不相同的。因此我们可以首先将我们的生物材料研磨成匀浆，然后通过离心的方法分离出细胞质和粗制细胞核，细胞核粗制品加入0.25mol/L蔗糖—柠檬酸溶液（含Ca2+,可防止细胞核凝集，维持细胞核的正常形态），混匀制成匀浆，然后选用高渗蔗糖—柠檬酸溶液作为梯度介质，调整离心力，通过密度梯度离心的方法进行离心，可以使细胞核单独沉淀于离心管底部，从而将细胞核与其他比重相接近的亚细胞结构分离开。在这里我要告诉大家细胞器沉降的先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。那接下来我们看一下在这个实验中需要用到哪些试剂？
实验试剂：1，生理盐水 2, 1.5%柠檬酸 3,0.25mol/L蔗糖—柠檬酸溶液 4， 0.88mol/L蔗糖—柠檬酸溶液 5， 核洗液 6， 0.02mol/L NaOH溶液，关于各试剂的作用我们在操作的时候会说到。接下来我们看一下具体的操作步骤。
（1）首先第一步就是肝细胞匀浆的制备。用颈椎脱位的方法杀死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块（去除结缔组织），尽快置于盛有生理盐水的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血液，剪碎，称取0.5g的肝组织，放入匀浆器中，加1.5%的柠檬酸溶液4.5mL，柠檬酸具有抑制核酸酶活性的作用，因此可以防止核酸的降解。反复研磨制成匀浆。再将匀浆用尼龙布过滤2-3次，除去残渣。
（2）分离细胞质和细胞核
a.将过滤好的匀浆液转入离心管中，放入普通离心机，大家注意一定要配平，然后以3500r/min的转速，离心15min.离心之后的上清液含有细胞质，要倒到另外一个试管中保留，待测定核酸时使用。
b.余下的沉淀物就是粗制的细胞核，然后加入0.25mol/L蔗糖—柠檬酸溶液1mL，用玻璃棒搅匀，制成细胞核悬液，在这个溶液中加入了CaCl2,因此含有Ca2+,这可防止细胞核凝集，能够维持细胞核的正常形态。
c.另取一个离心管，先加入0.88 mol/L蔗糖—柠檬酸溶液9Ml,用滴管吸取上述的核悬液，沿管壁缓缓铺于0.88 mol/L蔗糖—柠檬酸溶液面上，因为该溶液中含有蔗糖，且浓度较高，所以溶液比较黏，跟上面的核悬液能有一个明显的界面。然后再以2000r/min 转速离心10min,倾去上清液，将试管倒立于试纸上，以吸干余液，沉淀即为初步纯化的细胞核。
d.加入核洗液5mL，以2000r/min离心10min，除去上清液，再重复洗涤一次，得到的白色沉淀即为纯化的细胞核。
e.加5mL的0.02mol/L NaOH溶液使细胞核溶解为核液，保留，待测定核酸。 注意事项：1.红细胞与细胞核大小相似，可与细胞核一起沉淀，不易分离，因此从杀死动物到取出肝脏，动作要迅速，否则血液凝固，不易将红细胞洗净。 2 倾到上清时要求一次倒出，不得反复倾倒，防止震荡沉淀，影响结果。3 一定要正确使用离心机。
