梅衣属ITS条形码物种的快速鉴定
实验目的：
一、学习并熟练地衣DNA提取技术
二、掌握PCR技术的原理及操作
三、DNA条形码技术的应用
实验技术路线：
1、地衣总DNA的提取
2、PCR扩增
3、基因测序
4、基因序列对比
地衣总DNA提取：
1.取带有子囊盘或未有子囊盘的带藻地衣体30~300mg，用无菌水冲洗，除去表面杂质，再用DNA提取液浸泡2~3h（4℃）。
2.将地衣体取出，滤纸吸干表面液体，剪碎放于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状。
3.将粉末小心、全部转入1.5ml离心管中，加入400μL DNA提取液，混匀。
4.加入10% SDS 50μL、氯化苄150μL，振荡混合，于50℃保温1h，每隔10min振荡混合一次。
5.保温1h后，每管加入3mol/L NaAc 50μL，混匀冰浴15min.6.用等体积 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和等体积 酚：氯仿（1：1）各抽提一次，直至无白色沉淀为止。
7.移上清液于另一离心管，加入2倍体积无水乙醇，4℃放置2~3h ，15000r/min，离心10min（4℃），弃上清液。
8.将沉淀用70%乙醇冲洗2次后，真空干燥，再加入50~80μL TE缓冲液，保存于冰箱（4℃）
PCR扩增：
稀释50 倍用于后续 PCR 操作。真菌 ITS rDNA 由通用引 物 ITS5 （ 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′ ）、ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ ）。
PCR 反应条件：95℃预变性 5min； 95℃变性 30s，52℃退火 30s，72℃延伸 2min，反应 32 个循环；72℃延伸 10min，4℃保存。反应结 束后，PCR 产物通过 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验,ABI3730DNA 分析仪测序。
序列比对：
所获测序结果序列包含小亚基部分结尾序列、ITS1-5.8S-ITS
2、大亚基部分起始序列，去除大小 亚基部分序列后所得片段大小约 500bp，即为所需的序列
利用 DNAMAN（Lynnon Biosoft）软件将测序结果同 GenBank 下载数据进行 比对分析，如果序列长度不同，则只保留共有区段。
如果该DNA序列与GenBank中梅衣属的某个种的序列相同，则可确定所测定的地衣是哪个种。
实验试剂：
一、DNA提取
1、DNA提取液（50mmol/L Tris HCL pH9.0;12.5mmol/L EDTA pH8.0）: （1）称取7.5712gTris,加入150ml蒸馏水，加HCL调pH至9.0，定容至250ml （2）称取3.6531gEDTA，加入20ml蒸馏水，调pH至8.0，定容至250ml
2、10%SDS:称取10gSDS，加入100ml蒸馏水
3、NaAc：0.51g醋酸钠固体，加蒸馏水溶解，定容25ml
4、TE缓冲液：（1）1mol/L Tris-HCL(pH8.0) 1ml (2)0.5mol/L EDTA(pH8.0) 0.2ml 超纯水至100ml
5、氯化苄
二、pcr试剂准备
1.DNA模版
2．对应目的基因的特异引物
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5．Taq酶
二、详细配制比例
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5μl
dNTP mix （2mM） 4μl
引物1（10pM）2μl
引物2（10pM）2μl
Taq酶 （2U/μl）1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1μl
加ddH2O至 50μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液： 模板DNA
2μL 引物1
1μL 引物2
1μL dNTP
1.5μL MgCl2
2μL 10×buffer
2μL ddH2O
10μL Taq酶
0.5μL
