农业生物技术课程论文
题 目：_植物耐盐相关基因克隆与基因工程的研究进展
院（系）： 专业： 班级： 姓名： 学号： 成绩： 完成日期：
2011-6-10
农学院
植物耐盐相关基因克隆与基因工程的研究进展
摘要：随着分子生物学技术的不断发展，植物耐盐基因工程已经成为当前研究的热点．植物基因工程为耐盐新品种选育提供新的途径．很多耐盐相关基因相继被克隆和研究，包括离子调节关键基因、渗透调节物质合的关键基因、氧化胁迫调节关键基因、盐胁迫信号传导途径相关基因以及相关调控元件和因子，部分成功应用于植物育种研究．
关键词：耐盐性、基因克隆、基因工程、土壤盐渍化、耐盐基因
随着全球水资源危机以及土壤盐化问题的加剧，盐胁迫已经成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要限制因素。目前，世界盐渍土面积约１０亿ｈｍ２；中国盐渍土面积约３４６０万ｈｍ２，盐碱化耕地７６０万ｈｍ２，其中原生、次生盐化型和各种碱化型分布分别占总面积的５２％、４０％和８％。对于盐渍化土壤的利用主要采取两种措施，一是用化学或物理方法改造土壤；二是通过生物技术培育耐盐作物品种。前者不仅耗资巨大，且随着大量化学物质的加入加重了土壤的次生盐渍化，因此培育耐盐的作物品种就日益重要。国内外学者研究了盐分对植物的伤害、植物耐盐的机理，克隆了一些耐盐相关基因，并通过耐盐相关基因转化，获得了一些耐盐性提高的转基因植物，展示了诱人的前景。本文从植物耐盐的机理、耐盐相关基因的克隆及转耐进行了展望。
1、植物耐盐的机理
盐分对植物胁迫分为渗透胁迫、离子伤害、离子不平衡或营养缺乏三类，渗透胁迫和离子伤害目前被认为是对植物危害的两个主要过程。植物的耐盐性环境下的少数耐盐植物进化出特殊器官泌盐和稀盐，如海滩的红树和碱蓬属植物。对多数植物来说，则是生理耐盐。盐胁迫下渗透机制的调节在盐胁迫下，由于外界渗透压较低，植物吸收水分困难，细胞会发生水分亏缺现象。植物为了避免这种伤害，会主动积累一些可溶性物质，降低细胞的渗透势，从而使水分顺利地进入植物体内，保证植物正常生理活动的进行。渗透调节分为无机渗透调节和有机渗透调节。参与无机渗透调节的离子主要是Ｎａ＋、Ｋ＋、ｃａ２＋和ｃｌ。赵可夫等研究发现盐生植物的无机渗透剂以Ｎａ＋、Ｋ＋和ｃｌ为主，而非盐生植物高梁、芦苇等主要以Ｋ＋和有机渗透物质为主。说明盐生植物和非盐生植物在渗透调节物质方面的不同。植物在逆境中会主动积累一些有机渗透物质，其中小分子化合物有如下几类：第一类是多元醇，如甘如蔗糖、海藻糖等；第三类是氨基酸及其衍生物，如脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱等。这些物质对细胞无毒，对代谢过程无抑制作用，它们的积累在一定范围内可以维持盐胁迫下细胞的正常膨压和代谢功能。这些保护渗透物质在植物抗盐研究中已越来越受重视。
盐胁迫改变代谢途径在盐胁迫下，一些盐生植物能够通过改变其自身的代谢途径而适应高盐度的生存环境。一些肉质植物，如豆瓣绿属植物、马齿苋科植物以及禾本科植物冰草等，在盐渍或水分胁迫下可以改变光合碳同化途径，途径变为ＣＡＭ途径。ＣＡＭ植物在夜间开放气孔进行C0２吸收和固定，白天气孔关闭减少蒸腾量。这种转变的机理，赵可夫等认为主要是Ｃｌ活化了细胞中的ＲｕＢＰ羧化酶所导致的。并通过测量Ｃ０２固定和ＰＥＰ羧化酶活性证实光合作用转变是受盐诱导目前获得的一些转基因植物耐盐性虽有提高，但这只是相对于对照植株而言的，转入均是单个基因或相关的两个基因，并没有得到生产大田能利用的抗盐植株。目前比较一致的观点是：植物的耐盐性是多种生理性状的综合表现，是由位于不同染色体上的多个基因控制的，因此培育有实践意义的转基因植物可能需要同时转入多个基因。植物耐盐基因工程的工具基因植物作为固着生物，为了适应变化的环境就必须对胁迫产生快速应答，盐胁迫也不例外。植物耐盐应答机制主要包括生理和分子细胞两个水平，以下根据不同耐盐机制对相关基因进行分类介绍。 １．１离子调节相关基因
Ｎａ＋是盐渍土壤中主要的有害离子，在植物体中过量积累会破坏细胞膜结构、使膜选择性丧失、降低胞质酶活性、阻碍光合作用和代谢过程，引发离子胁迫。植物要在高盐环境下维持正常生长发育．降低胞质Ｎａ＋浓度是关键，为此植物细胞采取了限制Ｎａ＋内流、增加Ｎａ＋外排、Ｎａ＋区隔化等策略。高等植物中Ｎａ＋外排主要依赖于质膜Ｎａ＋／Ｈ＋反向转运蛋白，而植物囊泡中Ｎａ＋区隔化则通过液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋反向转运蛋白来实现。ＧａｘｉｏｌａＲＡ等人首先在拟南芥中克隆了编码液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋反向转运蛋白的ＡｔＮＨＸｌ基因。Ａｐｓｅ等人在拟南芥中超量表达ＡｔＮＨＸｌ基因提高了植株的耐盐性，并对番茄和油菜进行转化，得到了可在２００ｍＭＮａＣｌ条件下正常生长结实的转基因植株，获得了世界第一批真正意义上的耐盐作物。此后又分离了多种高等植物ＮＨＸｌ基因．ＣｈｅｎＬ Ｈ等人将ＡtＮＨＸｌ基因导人养麦，获得了可在２００ｍＭＮａＣＩ条件下生长开花且主要营养成分未受影响的转基因植株，此时野生型植株已无法正常生长。Ｎａ＋大量涌人还会破坏细胞内离子平衡，引发营养胁迫。但是质膜上没有Ｎａ＋特异转运蛋白，认为Ｎａ＋吸收是通过高亲和性及低亲和性Ｋ＋转运系统完成的，而Ｋ＋又在酶活性调节、蛋白质合成、渗透调节等生理过程中具有重要作用，可见保持胞质Ｋ＋浓度、维持Ｎａ＋／Ｚ＋比率不仅是植物生长也是抗盐的关键。ＨＫＴ类蛋白既可作为高亲和Ｋ＋转运体，又可作为Ｎａ＋转运体，也可能具有双重功能但选择性不同，认为ＨＫＴ蛋白在植物抗盐过程中发挥作用。ＳｃｈａｃｈｔｍａｎＤＰ等人率先克隆了小麦ＨＫＴＩ基因。此后克隆了多个植物ＨＫＴ蛋白同源基因。Ｒｅｎ等人从水稻中分离的编码ＨＫＴ型转运蛋白的ＳＫＣｌ基因，具有选择性转运Ｎａ＋的功能，有助于维持高盐条件下枝条中高Ｋ＋含量，促进植物生长。
ｌ.2 高盐环境下，外界渗透势较低会导致植物细胞水分亏缺，即产生渗透胁迫。为了抵御渗透胁迫，植物将积累小分子（糖醇、氨基酸、胺类化合物等）和大分子（水通道蛋白、保护性蛋白、渗调蛋白等）渗透保护物质，认为利用合成渗透保护物质的基因转化植物可以提高耐盐性。甘露糖醇一１一磷酸脱氢酶是甘露糖醇代谢途径中的关键酶，催化果糖合成甘露糖醇的反应。用大肠杆菌中编码甘露糖醇一卜磷酸脱氢酶的ｍｔｌＤ基因转化毛白杨得到的转化株可在７５ｍＭＮａＣＩ条件下生长，而野生株生长受到抑制。甘氨酸甜菜碱在植物细胞中积累可以增强植物耐盐性。其合成过程涉及胆碱单加氧酶和甜菜碱醛脱氢酶两个关键酶。目前大麦、水稻、菠菜、山菠菜和甜菜中的甜菜碱醛脱氢酶基因都已经被克隆。ＳｈｉｒａｓａｗａＫ等人使水稻超量表达菠菜ＣＭＯ基因，转化株甘氨酸甜菜碱含量较野生型提高９倍，可在１５０ｍＭＮａＣＩ条件下生长。ＫｕｍａｒＳ等人通过质体转化法使甜菜碱醛脱氢酶基因在胡萝卜中表达获得了可在４００ｍＭＮａＣｌ条件下生长的转基因植株，此时野生型植株已经无法存活，这是目前已知转基因植物所能耐受的最高盐浓度。ＬＥＡ蛋白能够在种子成熟干燥过程或渗透胁迫条件下保护细胞免受低水势损伤，ＬＥＡ基因是第一个鉴定到的在种子成熟和发育阶段表达的基因。ＨａｎＬＭ等人利用小麦ＬＥＡ蛋白编码基因Ｔ４——ＬＥＡｌ转化得到的丹参能够在１％ＮａＣｌ胁迫条件下生长。 １．３氧化调节相关基因
离子胁迫和渗透胁迫是高盐毒害的两个主要方面，它们还会诱发次级氧化胁迫，即产生活性氧自由基、破坏膜和酶系统。过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、维生素Ｅ、还原型谷胱甘肽、抗坏血酸还原酶等可作为植物体内保护酶系统协调作用清除膜脂过氧化产生的活性氧类物质，保护膜及细胞内酶系统不受破坏，利用相应编码基因对植物进行转化使抗氧化剂高水平积累可以有效提高耐盐性。ＧａｏＸ等人用２００ｍＭＮａＣｌ处理超量表达ｓＤＤ２基因的转基因和野生型拟南芥，二者发芽率均下降，但转化株发芽率下降水平仅为野生株的１／１０～１／３。表达水稻脱氢抗坏血酸还原酶基因的拟南芥能够在１００ｍＭＮａＣＩ条件下发芽，而此时野生株萌发受到抑制，证实增强植物脱氢抗坏血酸还原酶活性、提高总抗坏血酸盐含量可显著增强植物耐盐性。
１．4调控耐盐基因表达的转录因子
乙烯应答元件是植物中重要的特异转录因子，可以与乙烯应答ＧＣＣ盒和干旱应答元件发生互作。用编码乙烯应答因子型转录因子的大麦根富集因子基因转化拟南芥，对转化植株进行高盐处理后种子和根仍可正常萌发生长，表明大麦根富集因子基因对植物盐胁迫应答具有调控作用Ｃ２Ｈｚ型锌指蛋白是真核生物基因组中最丰富的锌指蛋白，其ＥＡＲ阻遏物结构域在植物非生物胁迫应答调节中具有重要作用。Ｃｉｆｔｃｉ ＹｉｌｍａｚＳ等人用Ｚａｔ７转化拟南芥，得到了可在１５０ｍＭＮａＣＩ条件下生长的转化植株，ＮａＣｌ浓度为１００ｍＭ时，野生型植株和ＥＡＲ结构域缺失或发生改变的突变植株就已经无法存活。近几年来，科学家们研究发现了一系列逆境胁迫相关基因，目前多个植物耐盐相关基因已被克隆而且这些基因与植物耐盐性状的关系也得到初步确认。
2 小分子渗透调节物质合成相关基因克隆及基因工程
在盐胁迫下，由于外界渗透势较低，植物细胞会发生水分亏缺现象，即渗透胁迫。植物为了避免这种伤害，在逆境情况下必须产生一种适应机制，多数植物能够通过积累大量的代谢物质如糖类（果糖、蔗糖、海藻糖等）、氨基酸（脯氨酸）等来调节植物细胞内渗透压与外界平衡，降低体细胞水势，保持膨压。维持高的细胞质渗透压，保证细胞的正常生理功能。Ｂｒａｙ认为脯氨酸、甜菜碱等小分子有机物的大量积累不会破坏其它生物大分子的结构和功能，同时表现出良好的亲和性，也具有较强的渗透调节作用，是理想的渗透物质。
2．1 甜菜碱
甜菜碱是一类铵化合物，化学名称为Ｎ一甲基代氨基酸。植物中的甜菜碱有１２种，最简单的、研究最多的甘氨酸甜菜碱。许多高等植物，尤其是藜科和禾本科穰物，在受到盐胁迫时积累大量甜菜碱，其积累水平与植物抗胁迫能力成正比。其生物合成是从胆碱开始经２步氧化生成的。首先在胆碱加单氧酶的催化下，胆碱合成甜菜碱醛，然后，甜菜碱醛在甜菜碱醛脱氲酶催化下形成甜菜碱。胆碱单加氧酶、甜菜碱醛脱氲酶两种酶都存在于叶绿体基质中，其活性受盐胁迫诱导。盐碱胁迫能使甜菜碱醛脱氲酶活性显著增加，并且与甜菜碱的积累具有相关性，但这方面的研究多限于幼苗或成熟植株以及胁迫诱导下植物体内甜菜碱含量及甜菜碱醛脱氲酶活性的动态变化。Ｍｅｎｇ等从苋中，克隆了胆碱单加氧酶基因全长ｃＤＮＡ，为一个编码４４２个氨基酸的多肽，通过ＤＮＡ印迹分柝该基因在基因组中为单拷贝，受予旱和盐胁迫诱导。甜菜碱醛脱氲酶是一个６０ｋＤ的多肽二聚体，主要集中在菠菜和甜菜叶绿体基质中。ＭｃＣｕｅ等在对甜菜进行的研究中克隆了３个负责编码甜菜碱醛脱氲酶的ｅＤＮＡ，发现三者的核酸序列差异较小。肖岗等从耐胁追很强的藜科植物山菠菜中克隆了甜菜碱醛脱氲酶的ｅＤＮＡ。Ｉｓｈｉｔａｎｉ等从大麦中克隆到了甜菜碱醛脱氲酶基因的ｅＤＮＡ，通过分析发现其与大肠杆菌中的胆碱单加氧酶基因有高度的同源性，同时发现该基因受干旱和盐胁迫诱导。目前甜菜碱醛脱氲酶的编码基因已经被应用到抗逆性基因工程当中：梁峥等将菠菜中的甜菜碱醛脱氢酶基因转入到烟草中，结果发现获得转基因植株中甜菜碱积累量显著增加，植株的抗旱以及耐盐牲均获得提高。郭北海等采爆基因枪法将由菠菜甜菜碱醛残氢酶基因导入小麦品种，并且得以表达。在盐胁迫条件下，多数转基因植株叶片的甜菜碱醛脱氲酶活性比受体亲本提高ｌ～３倍，部分植株相对电导率比亲本明显低，表明转基因植株的细胞膜在胁迫时有受损较轻倾向。孙仲序等将其成功地转入葡萄。
2．2 胃溶性糖
盐胁迫除了诱导一些小分子溶质外，还可诱导可溶性糖的变化，这蝗糖类有果聚糖、海藻糖等。这些可溶性糖类在植物体内也起到了重要的渗透压调节作用。果聚糖广泛存在于植物和微生物的细胞液泡中，而某些植物还能以果聚糖的形式储存光合作用固定的能量。果聚糖在细胞内是可溶的，在植物遭遇到盐胁迫能够降低细胞的水势，参与细胞的渗透调节。Ｐｉｌｏｎ Ｓｍｉｔｓ克隆到了枯草杆菌枯草杆菌果聚糖蔗糖转移酶基因，并将枯草杆苏打中枯草杆菌果聚糖蔗糖转移酶基因与液泡定位信号连接，启动子为组成型后，然后转入烟草。外源基因得到表达，转基因植株的非机构性糖类明显高于对照，在转基因甜菜植物中表达枯草杆菌果聚糖蔗糖转移酶基因，在胁迫条件下，能够积累暴聚糖，增强抗旱性。枯草杆菌果聚糖蔗糖转移酶基因基因对植物抗盐性的提高也有帮助，张慧等将枯草杆菌果聚糖蔗糖转移酶基因，与克隆自酵母的羧肽酶Ａ的液泡引导信号序列连接得到嵌合基因构建双元表达载体，经农杆菌介导转化烟草。获得的抗性芽能在含１％ＮａＣｌ的ＭＳ培养基上正常生根，转基因小苗浇灌含１％ＮａＣｌ的ｈｏａｌａｎｄ，Ｓ营养液转基因烟草植株生长良好，而未转化苗出现明显萎蔫，结果显示枯草杆菌果聚糖蔗糖转移酶基因基因的植物基因工程可提高烟草植株的耐盐性。海藻糖是一种还原性双糖，一般存在于低等生物（如酵母、细菌等）中，其化学结构和在维管植物中普遍存在的蔗糖的化学结构很相似，在胁迫环境下，海藻糖能够阻止细胞磷脂双分子膜由液晶态向固态转变，能够稳定蛋白质等高分子物质，从而增加细胞对盐胁迫的抵抗力。另外，在一些极端耐旱的复苏植物含有大量海藻糖，对其抵御干旱胁迫起到了至关重要的作用，可以使其桔死后得以复活。在酵母中，海藻糖的合成由海藻糖一６一磷酸合酶和海藻糖一６一磷酸磷酸酶共同完成。通过转基因，使植物产生和积累海藻糖，提高植物抗旱性的工作已经有报道，Ｈｏｌｍｓｔｒｍ等将海藻糖一６一磷酸合酶基因转入烟草，转基因植株胁迫后复水可恢复生长，而对照则枯萎了。表现出海藻糖一６一磷酸合酶基因能够提高植物的耐脱水能力。赵恢武的结果证实海藻糖一６一磷酸合酶基因能够提高烟草抗旱性，但发现烟草的正常生长受到影响。王自章等利用农杆菌介导法将海藻糖合酶基因转入甘蔗，获得抗渗透胁迫能力增强植株。酵母的羧肽酶Ａ的液泡引导信号序列连接得到嵌合基因构建双元表达载体，经农杆菌介导转化烟草。获得的抗性芽能在含１％ＮａＣｌ的ＭＳ培养基上正常生根，转基因小苗浇灌含１％ＮａＣｌ的ｈｏａｌａｎｄ，Ｓ营养液转基因烟草植株生长良好，而未转化苗出现明显萎蔫，结果显示枯草杆菌果聚糖蔗糖转移酶基因基因的植物基因工程可提高烟草植株的耐盐性。海藻糖是一种还原性双糖，一般存在于低等生物（如酵母、细菌等）中，其化学结构和在维管植物中普遍存在的蔗糖的化学结构很相似，在胁迫环境下，海藻糖能够阻止细胞磷脂双分子膜由液晶态向固态转变，能够稳定蛋白质等高分子物质，从而增加细胞对盐胁迫的抵抗力。另外，在一些极端耐旱的复苏植物含有大量海藻糖，对其抵御干旱胁迫起到了至关重要的作用，可以使其桔死后得以复活。在酵母中，海藻糖的合成由海藻糖一６一磷酸合酶和海藻糖一６一磷酸磷酸酶共同完成。通过转基因，使植物产生和积累海藻糖，提高植物抗旱性的工作已经有报道，Ｈｏｌｍｓｔｒ６ｍ等将海藻糖一６一磷酸合酶基因转入烟草，转基因植株胁迫后复水可恢复生长，而对照则枯萎了。表现出海藻糖一６一磷酸合酶基因能够提高植物的耐脱水能力。赵恢武的结果证实海藻糖一６一磷酸合酶基因能够提高烟草抗旱性，但发现烟草的正常生长受到影响。王自章等利用农杆菌介导法将海藻糖合酶基因转入甘蔗，获得抗渗透胁迫能力增强植株。 ３与耐盐性相关的调控元件和因子
植物在生长过程中，对各种环境胁迫会做出一系列反应，特异表达一些基因，以适应不利的环境条件。这就要求对各种功能的基因进行精确的调控。透过研究这些基因的表达，发现很多基因的表达受到其启动子附近的顺式作用元件以及与之相结合的反式作用因子的调控。在拟南芥中，Ｐｉｌｏｎ Ｓｍｉｔｓ等报道了一批受脱水诱导的基因Ｒｄ，其中一个受脱水和低温诱导基因ｒｄ２９Ａ的启动子中的一个９ ｂｐ的脱水响应元件，碱基序列为ＴＡＣＣＧＡＣＡＴ，是一种典型的顺式作用元件。刘强等通过对比其它受干旱、高盐以及低温诱导的基因，发现这些基因的启动子都有ＤＲＥ核心序列。可以认为ＤＲＥ核心对这些基因在逆境下表达起着调控作用。反式作用因子的编码基因能够促进相应基因的表达。Ｌｉｕ等发现属于一个基因家族的两个转录因子基因ＤＲＥＢＩＡ和ＤＲＥＢ２Ａ，表达产物为ＤＲＥ结合因子，结合在ｒｄ２９Ａ基因的启动子区域，分析认为ＤＲＥＢｌＡ和ＤＲＥＢ２Ａ是相互独立的、在分属不同的干旱和盐胁迫信号传导途径中起着反式作用因子的作用。并发现转整合了组成型启动子３５Ｓ后的ＤＲＥＢＩＡ和ＤＲＥＢ２Ａ基因的拟南芥能够显著提高抗胁迫能力，但ＤＲＥＢＩＡ过量表达，对其的正常生长产生不良影响。当在干旱诱导型启动子ｒｄ２９Ａ的启动子驱动下，这种负面影响降到最低限度，仍然能观测到增强的抗胁迫能力。
４展望
土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的一个重要的非生物胁迫因素。通过基因工程来培育耐盐的农作物新品种为有效解决这个问题提供了一个薪的思路。对予植物耐盐基因工程来讲，获得关键耐盐基因尤为重要，随着功能基因组学的开展，以及表达序列标签及ｃＤＮＡ微阵列、基于转座子标签和Ｔ—ＤＮＡ标签的反求遗传学技术等新技术的应用，使得关键的耐盐基因的分离及其功能鉴定变得更容易了。相信随着分子生物学技术和方法的不断发展和完善，植物耐盐性的分子机理将逐步被了解，进而使通过基因工程方法提高植农作物耐盐性成为可能。
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