期末考试复习题
吸附法和离子交换
1、吸附作用机理是什么？按作用力可分为哪几种？
答：固体表面分子(或原子)处于特殊的状态。固体内部分子所受的力是对称的，故彼此处于平衡。但在界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、原子、或离子，并在吸附表面上形成多分子层或单分子层。
按作用力可分为：物理吸附，化学吸附和离子交换
2、吸附法有几种？各自有何特点？
答：吸附法按吸附作用力分主要有三类，物理吸附、化学吸附和离子交 换。
特点：
物理吸附基于吸附剂与溶质之间的分子间作用力即范德华力。溶质在吸附剂上吸附与否或吸附量的多少主要取决于溶质与吸附剂极性的相似性和溶剂的极性。一般物理吸附发生在吸附剂的整个自由表面，被吸附的溶质可通过改变温度、PH和盐浓度等物理条件脱附。
化学吸附释放大量的热，吸附热高于物理吸附。化学吸附一般为单分子层吸附，吸附稳定，不易脱附，故洗脱化学吸附质一般需采用破坏化学结合的化学试剂为洗脱剂。化学吸附具有高选择性
离子交换吸附所用吸附剂为离子交换剂。离子交换剂表面含有离子基团或可离子化基团，通过静电引力吸附带有相反电荷的离子，吸附过程发生电荷转移。离子交换的吸附质可以通过调节PH或提高离子强度的方法洗脱。
3、大孔网状聚合物吸附与活性炭吸附剂相比有何优缺点？
答：大孔网状聚合物吸附剂机械强度高，使用寿命长，选择性能好，吸附质容易吸附，并且阻力小，常应用于抗生素和维生素B12等的分离浓缩过程。
4、影响吸附过程的因素有那些？ 答：影响吸附的因素
（1）吸附速度
由于大分子分子量大，扩散慢，且吸附时常伴随着分子构型的变化，故其吸附速度慢，这就给讨论大分子吸附带来困难。
（2）分子量的影响
对孔性固体， 分子量增加，吸附量减少。对大孔或非孔固体 α=1只有1个吸附点 α=0表示大分子完全平躺。
（3）溶剂的影响
在溶剂中，大分子较伸展，吸附量减少。 若溶剂产生竞争吸附，吸附量减少。
（4）温度的影响
存在着温度升高使吸附量下降和温度升高使吸附量升高两种情况。第二种情况可认为吸附是吸热过程△H>o，但△G
（5）PH值
活性炭一般在酸性溶液中比在碱性溶液中吸附效果较好。
（6）共存物质：对于物理吸附，共存多种物质时的吸附比单一物质时的吸附要差。
（7）吸附剂性质的影响
（a）溶解度：越低越容易吸附，具有较大的影响。
（b）使液体表面自由能W降低得越多的吸附质则越容易被吸附。 （c）极性：极性吸附剂易吸附极性的吸附质，非极性吸附剂易吸附非极性的吸附质。
（d）吸附质分子的大小和不饱和度。活性炭易吸附分子直径较大的饱和化合物；合成沸石易吸附分子直径小的不饱和化合物
（e）吸附质的浓度较低时，提高C可增加吸附量。以后C↑，q增加很小，直至为一定值
5、何谓离子交换法?一般可分为那几种? 答：离子交换吸附：吸附剂为离子交换剂，离子交换剂表面含有离子基团或可离子化基团，通过静电引力吸附带有相反电荷的离子，吸附过程中发生电荷转移，离子交换的吸附质可通过调节PH或提高离子强度的方法洗脱。
根据吸附过程中所发生的吸附质－吸附剂之间的相互作用的不同，还可将吸附分成亲和吸附、疏水吸附、盐析吸附和免疫吸附等。
6、离子交换树脂的结构、组成？按活性基团不同可分为那几大类？
离子交换剂通过化学修饰制备，主要有苯乙烯-二乙烯苯型、丙烯酸-二乙烯苯型、酚醛型和多乙烯多胺-环氧氯丙烷型树脂。这些交换剂附着在离子交换剂基质上。
应用于无机离子交换和生物小分子回收、提取的离子交换剂疏水性高、交联度大、孔径小、电荷密度高；应用于蛋白质分离的具有很高的亲水性和较大的孔隙半径，以减少蛋白质的非特异性吸附，是蛋白质容易进入离子交换剂的内部。
按活性基团的不同，可分为：活性基团为酸性的阳离子交换剂和活性基团为碱性的阴离子交换剂。
7、离子交换树脂有那些理化性能指标？
答：（１）交换容量(exchange capacity) 指单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数(mmol)，是表征交换剂离子交换能力的主要参数。
PS：交换容量的测定：对于阳离子交换剂：用HCl将其处理成氢型，称重并测定其含水量；称数克交换剂，加入到过量已知浓度的NaOH溶液，发生交换反应，待反应达到平衡后(强酸性的需要静置24h，弱酸性的需静置数日)，测定剩余的NaOH摩尔数，就可求得阳离子交换剂的交换容量。对于阴离子交换剂：将阴离子交换剂转换成Cl型后，取一定量的Cl型交换剂，通入Na2SO4,用铬酸钾作指示剂，用硝酸银溶液滴定流出液的Cl-，根据Cl-量计算交换容量。
（２）滴定曲线（全面评价表征交换剂的重要参数）
方法：1g氢型(或羟型)交换剂 + x-ml 0.1M NaOH/or HCl + 水至50 ml(其中1支 + 50 ml 0.1 M NaCl) + 静置24h (对强交换剂)/or 7d(对弱交换剂) + 测pH + 作图
意义：强酸（碱）性离子交换的滴定曲线开始是水平的，到某点突然升高（或降低），表明在该点交换剂上的离子交换基团已被碱（或酸）完全饱和；弱酸（或碱）性离子交换剂的滴定曲线逐渐上升（或下降），无水平部分。利用滴定曲线的转折点，可估算离子交换剂的交换容量；而由转折点的数目，可推算不同离子交换基团的数目。
8、pH值是如何影响离子交换分离的？
mXKAX XHXH mX[RX-][X][XH]KXU[RU-]KAX [U]KAX[H]可见当PH值增大时弱电解质的离子交换的分配系数增大，而对强电解质没有影响，可从下式看出 mX[RX-][X] mXKXU[RU-][U]
9、何谓穿透曲线？
答：穿透曲线
（1）吸附带：指正在发生吸附作用的那段填充层，在吸附带下部的填充层几乎没有发生吸附作用，而在吸附带上部的填充层已达到饱和状态，不再起吸附作用。
（2）穿透曲线：以吸附时间或吸附柱出水总体积为横坐标，以出水吸附质浓度为纵坐标所绘制出的曲线叫穿透曲线。
另解：吸附过程中吸附塔出口溶质浓度的变化曲线穿透曲线 （3）穿透点：出口处溶质浓度开始上升的点成为穿透点。达到穿透点所用的操作时间称为穿透时间。一般习惯上将出口浓度达到入口浓度的5％～10％的的时间成为穿透时间。
（4）吸附终点：出水浓度Cb为(0.90~0.95)Co时所对应的出水总体积的穿透曲线上的那一点叫吸附终点（耗竭点）。
色层分离
1、何谓色层分离法？可分为那几大类？
答：色层分离法：又称层析分离法，色谱法，是利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配从而是各组分达到分离的一种物理化学分析方法。
2、简述柱层析系统的工艺流程。
答：层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨好。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。
工艺流程如下： （1）层析材料的准备
许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低
（2）装柱
层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至1／3体积，并使支持板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在拄内。让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂。为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。
（4）加样
上柱前，先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样品溶液体积，使区带狭窄。将样品仔细加到层析床的表面，打开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。
（5）洗脱
用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。使用洗脱法，上柱量不超过总柱容量的10％，溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。在一个组分被洗脱后可以更换洗脱液，这就是所谓的分步洗脱。另外，还有一个可行的方法是逐渐改变溶剂的性质，形成一个离子强度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱，这种方法称梯度洗脱，它的优点之一是能够减少拖尾现象。
（6）部分收集及分析
柱的流出液可以用人工的方法收集到一系列试管中或使用部分收集器。这种装置能使每一管按照预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。每一部分的蛋白质或核酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280 nm或260 nm的光吸收来进行连续监测。
3、何谓保留值、分配容量K、分离度？ 答：1）保留值
（1）死时间 t0
不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积。
因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与t0的比值计算，即 ū = L/t0
（2）保留时间tr 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间 （3）调整保留时间tr´
ａ 某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即 tr´= tr－t0 ｂ 由于组分在色谱柱中的保留时间tr 包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr 实际上是组分在固定相中保留的总时间。
ｃ 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。 （4）死体积V0
指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。
V0 = t0*Fco 式中 Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。
b 仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。 （5）保留体积Vr 指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：
Vr= tr *Fco （6）调整保留体积Vr′
某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。
Vr′ = Vr－V0 = tr′* Fco （7）相对保留值r2,1 某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。 r2,1= tr2 ′ / tr1´= Vr2′ / Vr1′
由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。 2）容量因子，即分配比 k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即
k = 组分在固定相中的质量/组分在流动相中的质量 ＝ ms/mm 3）分离度定义式
分离度：又称分辨率，是两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值之比（衡量色谱分离条件优劣的参数）
4、色层图中分离度有哪几种表示方法？见课本ｐ169 分辨率表示法 R=2(θR2－θR1)/(W1+W2) 容量因子表示法 k’＝m H 选择性表示法 α＝K2’/K1’ 柱效表示
5、层析剂有那几种？各自有何特点？
疏水性吸附剂，金属螯合层析剂，二硫键层析剂，凝胶，硅胶等反向介质
6、何谓亲和色层分离法？亲和力的本质是什么？亲和色层中常用的亲和关系有那几种？
答：（１）利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（Affinity purification ）。亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。
（2）亲和力的本质：1.静电作用：亲和作用分子对的结合部位上带有相反电荷时，产生静电引力。在中性pH下，蛋白质分子上酸性氨基酸残基可带负电荷，碱性氨基酸残基可带正电荷。此外N末端氨基酸的-氨基带正电，C末端氨基酸的羧基带负电。2.氢键：如果亲和作用分子对的一方分子中含有氧原子或氮原子，结合部位之间可以产生氢键作用，即形成O···H－O 或O···H－N。氢键的产生与否受结合部位之间位置关系的严格制约。3.疏水性相互作用：如果亲和作用分子对的一方分子上含有芳香环或烃基链等疏水基，另一方的结合部位上也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性相互作用。4.配位键：如果亲和作用分子对均与同一金属原子配位，则两者之间可通过金属配位键间接结合。5.弱共价键：弱共价键是指结合力较弱的可逆共价键。当亲和作用分子对之间满足形成弱共价键的条件时可能形成弱共价键。
具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔” 的空间结构关系。 （３）亲和色层中常用的亲和体系： 特异性 亲和作用体系 高特异性 抗原----单克隆抗体
荷尔蒙----受体蛋白
核酸----互补碱基链段、核酸结合蛋白
酶----底物、产物、抑制剂
群特异性 免疫球蛋白----A蛋白、G蛋白
酶----辅酶
凝集素----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体
酶、蛋白质----肝素
酶、蛋白质----活性色素（染料）
酶、蛋白质----过度金属离子
酶、蛋白质----氨基酸（组氨酸等）
7、柱层析法与固定床吸附法有何异同点？
相同点：操作过程中都存在两相，即固定相和流动相。都能对溶质分子起到分离作用。 不同点：操作完成后，层析法的目标产物仍然存在于流动相中，只是由于洗出时间的不同而在不同时间得到不同产物，溶质的分离程度由分辨率判断；固定床吸附法的吸附物存在于固相中（即由液相或气相转移到固相），产物的分离纯度取决于吸附剂的分离性质。
操作方法上，柱层析是间歇操作，而固定床吸附是连续操作。在完成操作后，层析柱可以开始下一次分离，而固定床吸附法在达到穿透点之后需要停止吸附操作，转入吸附质洗脱和吸附剂再生操作。
8、色谱柱理论板数和塔板高度的计算？
答：根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数n的公式，用以评价一根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数： 可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。
若柱长为L，则每块理论塔板高度H为
由上述两式知道，理论塔板数n越多、理论塔板高度H越小、色谱峰越窄，则柱效越高。
但上述两式包含死时间t0，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以有效塔板数neff 和有效塔板高度Heff 表示
9、常用的亲和吸附介质有哪些？ 答：（1） 酶的抑制剂 酶的抑制剂有天然的生物大分子，也有小分子化合物。例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶抑制剂(pancreatic trypsin inhibitor; PTI)等，小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸等，均可作为亲和纯化胰蛋白酶的配基。
（2）抗体
利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱(immuno- affinity chromatography)。抗体与抗原之间的Keq一般为107～1012 L/mol。因此，利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。
（3） A蛋白
protein A为分子量约42 kD的蛋白质，与IgG具有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。
不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。
A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。
（4） 凝集素
凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称。
伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。pH＜5.6时con A为二聚体，分子量为52 kD；pH＞5.6时为四聚体，分子量为102 kD，两个亚基（subunit）之间通过二硫键结合。因此，在利用con A为配基的亲和色谱操作中，操作条件应当适宜。
（5）辅酶和磷酸腺苷
脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有NAD（nicotinamide adenine dinucleotide）、NADP（NAD phosphate）和ATP（adenosine triphosphate）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。
AMP (adenosine 5\'-monophosphate)、ADP（adenosine 2\'，5\'-diphosphate）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和配基。
（6） 三嗪类色素
利用色素为配基的亲和色谱法又称色素亲和色谱（Dye-ligand affinity chromatography）。
Triazine dyes是一类分子内含有三嗪环的合成染料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模拟色素（biomimetic dye）。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、干扰素、核酸酶和糖解酶等具有很高的亲和力。
（7） 过渡金属离子
Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。
这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为金属螯合色谱（metal chelate chromatography）或固定化金属离子亲和色谱(immobilized metal affinity chromato-graphy, IMAC)。
（8）组氨酸
组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。
在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质pI的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。
（9）肝素
肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5至30 kD，具有抗凝血作用。
肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。
肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低
10、亲和层析中目标产物的洗脱有哪几种方法？ 各有何优缺点？
答：特异性洗脱利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物，洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对特异性较低的体系或非特异性吸附较严重的物系，特异性洗脱法有利于提高目标产物的纯度。
非特异性洗脱是通过调节pH值、离子强度、离子种类和温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。优点为成本低，速度快，吸附介质再生容易。缺点是洗脱体积大，目标产物在洗脱中浓度较低。如果要提高浓度或是配基与目标产物结合较强时，要选择适当的pH值及离子强度或加入变性剂，如果选择不当，可能造成目标产物失活。
电泳
1、电泳的概念
答：带电质点在电场中向带有异相电荷的电极迁移的现象称为电泳。
2、电泳的基本原理
答：电泳分离利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离
3、电泳技术的分类
答：有区带电泳、等电点电泳和等速电泳。这些电泳法又根据是否使用凝胶载体分为凝胶电泳和自由流电泳。
4、基本的电泳系统组成
电源、电极、成形盘、胶梳、胶槽、外盖
5、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理
答：常规聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，可形成大小不同的孔径，具有很强的分子筛作用。电泳利用凝胶的分子筛作用使分子大小或带电荷不同的电解质得到分离：相对分子质量大的溶质受凝胶的阻滞作用大，泳动速度较慢，而小分子溶质泳动速度较快。
6、SDS- PAGE的分离原理
答：SDS-PAGE引进阴离子表面活性剂SDS（十二烷基磺酸钠）。SDS与蛋白质的疏水部位结合，能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，减少了蛋白质分子之间的聚集作用。蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
7、何谓等电聚焦？如何形成载体两性电解质pH梯度？
在凝胶中加入两性电解质（如Amnpholine),通电后，凝胶中构成从正极到负极逐渐增加的pH梯度,处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动,最后各自停留在其等电点的位置上,利用气压力将已等电聚焦的样品推动,经过检测器进行检测。
两性电解质为数百至数千种混合物，各个组分具有不同的等电点，所以在通电以后，能够形成载体两性电解质pH梯度。
作业摘抄：
