《分离》PPT思考题及部分答案
分离概述
1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？ 生物下游加工过程特点：
：发酵液组成复杂，固液分离困难——这是生物分离过程中的薄弱环节
：原料中目标产物含量低，有时甚至是极微量——从酒精的1/10到抗菌素1/100，
酶1/100万左右，成本高。
：原料液中常伴有降解目标产物的杂质——各种蛋白酶降解基因工程蛋白产物，
应快速分离。
：原料液中常伴有与目标产物性质非常相近的杂质——高效纯化技术进行分离。
：生物产品稳定性差 ——严格限制操作条件，保证产物活性。
：分离过程常需要多步骤操作，收率低，分离成本高——提高每一步的产物收得
率，尽可能减少操作步骤。
：各批次反应液性质有所差异——分离技术具有一定的弹性。 2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？
(1)产品的性质（2）成本（3）工艺步骤（4）操作程序（5）生产方式（6）生产规模 （7）产品稳定性（8）环保和安全 3 初步纯化与高度纯化分离效果有何不同？
（1）初步纯化是将目标物和与其性质有较大差异的杂质分开，使产物的浓度有较大幅度的提高，可采用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作.（2）高度纯化主要是除去与目标物性质相近的杂质，是产品的精制过程，可采用层析（柱层析和薄层层析）、离子交换、亲和色谱、吸附色谱、电色谱.4 如何除去蛋白质溶液中的热原质？
（1）生产过程无菌（2） 所有层析介质无菌（3） 所用溶液无菌（4）亲和层析（多粘菌素） 5 生物分离为何主张采用集成化技术？
6 纯化生物产品的得率是如何计算的？若每一步纯化产物得率为90%，共6步纯化得到符合要求产品，其总收率是多少？
得率=产品中目标产物总量/原料中目标产物总量 总收率=（90%）6 =53.1441%
发酵液预处理
1 发酵液为何需要预处理？处理方法有哪些？
1、发酵产物浓度较低，大多为1%—10%，悬浮液中大部分是水；
2、悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；
3、固体粒子可压缩性大（细胞在很大程度上属于可压缩的粘稠物料）；
4、液相粘度大，大多为非牛顿型流体；
5、性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白质酶水解等作用的影响。 处理方法： （1）凝集和絮凝 （2）加热法 （3）调pH法 （4）加水稀释 （5）加助滤剂法 （6）加吸附剂或加盐法 （7）热处理法
（8）离子交换和活性炭吸附法
2 如何使用助滤剂? 助滤剂的使用方法有两种： ①在过滤前先在过滤介质表面预涂（铺）一层助滤剂。 ②助滤剂按一定比例均匀加入待过滤的料液中。 3 凝集与絮凝过程有何区别？如何将两者结合使用？
答：凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１ mm 大小块状凝聚体的过程。机理：a 中和粒子表面电荷
b 消除双电层结构 絮凝：指使用高分子絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团（10mm）的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。机理：架桥作用
结合使用：在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，由于能降低ζ电位和脱除胶粒表面的水化膜，就能导致胶粒间的凝聚作用 4 错流微滤与传统过滤相比有何优点？
（1）传统过滤作用是由两个过程组成：筛选作用和吸附作用。如果微粒比滤层的孔隙大，即产生筛选作用。混浊微粒被截留，不仅是筛选作用的结果，也是过滤层里面发生的吸附作用的结果。在悬浮微粒过滤时，微粒的直径使它不可能通过缝隙的入口时，被截留在过滤层的表面上，微粒又形成了第二道过滤层，在入口孔隙的上方积累，随之堵塞了他们。 （2）错流过滤打破了传统过滤的机制，即液体的流向和滤膜相切，使得滤膜的孔隙不容易堵塞。被过滤的发酵液在压力推动下，带着混浊的微粒，以高速在管状滤膜的内壁流动，而附着在滤膜上的残留物质很薄，其过滤阻力增加不大，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度。优点: 1.克服介质阻力大 2.不能得到干滤饼 3.需要大的膜面积
4.收率高 5.质量好 6.减少处理步骤
7.染菌罐也能进行处理
细胞破碎
1.细胞破碎的常用的方法有哪些？
珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法 2.机械法、超声波法等在破碎细胞时应该共同注意什么？
3.酶消化法和碱处理法都是细胞破碎的有效方法，但是也都有各自的什么缺点？ 酶消化法缺点：
（1）价格高，通用性差，产物抑制的存在 碱处理法缺点： （1）操作时间长 （2）易引起活性物质失活
（3）对产物存在着一定的毒性且会给产物的纯化带来困难，影响产物浓度 4.工业生产中对于细胞破碎常用的生产工艺流程有那些？
沉析、沉淀
1.理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶， 盐析
2.常用的蛋白质沉淀方法有哪些？ （1）盐析法
（2）有机溶剂沉淀法 （3）等电点沉淀法 （4）非离子多聚物沉淀法 （5）生成盐复合物法 （6）选择性变性沉淀 （7）亲和沉淀
3.影响盐析的主要因素有哪些？
盐析：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象。
影响盐析的主要因素：溶质种类的影响：Ks和β值
溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；
蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；
pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量，通常调整体系pH值，使其在pI附近；
盐析温度：大多数情况下，高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降；
4.何谓中性盐的饱和度？盐析操作中，中性盐的用量（40% 硫酸铵饱和度）如何计算？
0～300C 溶解度变化很小，加入水中后溶液体积会变大（必须考虑到）。
200C 1L加至饱和浓度时体积变大为：1.425L(实际应加入) 761g
因此，要使1L溶液浓度由M1增加到M2需要加入多少克（NH4）2SO4需要按下式计算：
200C时—— G=533（M2-M1）/（4.05-0.3M2）或533（S2-S1）/（100-0.3S2）
00C时—— G=505（M2-M1）/（3.825-0.285M2）或505（S2-S1）/（100-0.285S2） 5.有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？用乙醇沉淀蛋白质时应注意哪些事项？
②有机溶剂沉淀蛋白质的机理是：
向蛋白质溶液中加入有机溶剂，水的活度降低。随着有机溶剂溶度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团的水化程度降低，液体的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而凝聚和沉淀。
③用乙醇沉淀蛋白质时
应注意的事项：
1、低温条件下操作可以提高收率和减少蛋白质失活变性（加入有机溶剂为放热反应）；
2、采用的有机溶剂必须与水互溶，与蛋白质不发生作用；
3、蛋白质分子量越大，需要加入的溶剂量越少；
4、一种蛋白质的溶解度常会因为另一种蛋白质存在而降低；
5、沉淀的蛋白如果不能再被溶解，可能已经变性；
6、很多酶和蛋白质在20-50%（V/V）就能产生沉淀；当溶剂量达到50%时，通常只有
分子量≤1500的蛋白留在溶液中；
7、PH=PI时，需要加入的溶剂量减少；
8、盐析法沉淀的蛋白质采用有机溶剂精制时必须与先进行透析。
离心
1.工业生产时在什么情况下面采用离心的方法来分离产物？ 当发酵液不易被过滤纯化时，我们可以采用离心的方法来分离。 2.工业生产时最有可能使用的是那三种离心机？ 管式离心机、碟片式离心机、离心过滤机
3.工业生产时经常使用的三种离心机的各自特点是什么？
4.什么是澄清操作?什么是分离操作? 液-固分离:即低浓度悬浮液的分离，称澄清操作。 液-液(或液-液-固）分离: 即乳浊液的分离，称分离操作。
膜分离技术
1 理解概念：截留分子量，截留率，体积浓缩倍数
2 微滤，超滤，反渗透分离技术在分子尺寸上有何区别？
3 影响截留率的因素有哪些？
分子的形状、吸附作用、温度、流速、pH、离子强度（影响蛋白构象） 4 毛细管流动模型，溶解扩散模型和优先吸附模各适用于解释哪些膜过程?
5 膜污染有哪些途径造成？如何有效防止和清除膜污染？ 污染的原因有A、凝胶极化引起的凝胶层，阻力为Rg B、溶质在膜表面的吸附层，阻力为Ras C、膜孔堵塞，阻力为Rp D、膜孔内溶质吸附，阻力为Rap 防止：预处理、开发抗污染膜、加大流速、化学清洗、物理清洗 膜的清洗：
①机械方法：加海绵球，增大流速，逆洗(对中空纤维超滤器)，脉冲流动，超声波等。
②化学方法
用起溶解作用的物质：如：酸、碱、酶(蛋白酶)，螯合剂，表面活性剂。 用起切断离子结合作用的方法：如改变离子强度、pH、电位。 起氧化作用的物质：如过氧化氢、次氯酸盐。 用起渗透作用的物质：如磷酸盐、聚磷酸盐
结晶
1 理解概念：晶种，晶核，晶型，饱和溶液，过饱和溶液，饱和度 晶核：在结晶过程中最先析出的微小颗粒(小晶体)是以后结晶的中心
饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；
过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液； 2 粒子大小与溶解度有何关系？凯尔文公式的内容？ 粒度大小与溶解度之间的关系可用开尔文方程式表示：
lnc12M11() c2RTL1L2式中：C
1、C2---分别是曲率半径为L
1、L2的溶质的溶解度
R---气体常数
T---绝对温度
ρ---固体颗粒密度
M---溶质的分子量
σ---固体颗粒与溶液间的表面张力
在结晶过程中最先析出的微小颗粒(小晶体)是以后结晶的中心，称为晶核，微小晶核具有较大的溶解度，因此在饱和溶液中，晶核是要溶解的。只有达到一定的过饱和度时，使晶核半径r大于临界半径rc，晶核才能存在。因此，溶液达到过饱和浓度是沉淀结晶的前提，过饱和度是沉淀结晶的推动力，过饱和度越大，推动力就越大，析出沉淀结晶的可能性就越大。 3 有哪些方法造成溶液过饱和？
过饱和溶液的形成方法
(1) 冷却 (2) 溶剂蒸发 (3) 改变溶剂性质
(4) 化学反应产生低溶解度物质 (5)真空蒸发法 (6)盐析法
4 初级成核与次级成核是如何形成的？ 初级成核:过饱和溶液中的自发成核现象
二次成核：向介稳态过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产生
5.了解饱和温度曲线和过饱和温度曲线的内容？
结晶过程中的饱和温度曲线和不饱和温度曲线的简图如右图所示：
S-S曲线为饱和温度曲线，在其下方为稳定区，在该区域溶液为不饱和溶液，不会自发结晶；
T-T曲线为过饱和温度曲线，在其上方为不稳定区，能够自发形成结晶；
S-S曲线和T-T曲线之间为亚稳定区，在该区域，溶液为过饱和溶液，但若无晶种存在，也不能自发形成晶体；
7.常用的工业起晶方法有哪些？ 自然起晶法、刺激起晶法、晶种起晶法 8.影响晶体质量的因素有哪些？
过饱和度、温度、搅拌、晶种、溶液纯度 9.何为重结晶？
重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作
萃取
1.理解概念：分配系数，分离因子，溶解度参数，介电常数，HLB 值 ，萃取因数，带溶剂 分配系数：当萃取体系达到平衡时，溶质在两相中的总浓度之比。 分离因子：衡量分离的程度。
介电常数:是化合物mol极化程度的量度，又称电容率。表征电介质极化性质的宏观物理量。定义为电位移D和电场强度E之比D=εE 萃取因数:也称萃取比，其定义为被萃取溶质进入萃取相的总量与该溶质在萃余相中总量之比。
溶解度参数:是衡量液体材料相容性的一项物理常数。其物理意义是材料单位体积内聚能密度的开平方。
HLB数即亲水与亲油平衡程度：HLB数越大，亲水性越强，形成O／W型乳浊液；HLB数越小，亲油性越强，形成W／O型乳浊液。
带溶剂：是指这样一些物质，它们能和产物形成复合物，使产物更易溶于有机溶剂相去，该复合物在一定条件下又要容易分解。
2.生物物质的萃取与传统的萃取相比有哪些不同点？ （1）成分与相复杂 （2）传质速率不同
（3）相分离性能不同（固体与表剂） （4） 产物的不稳定性
3.pH 对弱电解质的萃取效率有何影响？
主要表现在两方面：pH影响分配系数。一般弱酸性电解质的分配系数随pH降低而增加； 弱碱性电解质的分配系数随pH降低而升高。pH影响选择性。一般在酸性条件下，酸性产物可被有机溶剂萃取得到，而碱性杂质则会形成盐留在水相中；对于碱性产物应在碱性条件下萃取。pH还影响产物的稳定性。
4.发酵液乳化现象是如何产生的？对分离纯化产生何影响? 如何有效消除乳化现象？ 产生：发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有表面活剂性的作用，使有机溶剂和水的表面张力降低（乳化剂），产生两种乳浊液： 油包水型W/O乳浊液、水包油型O/W型乳浊液。
乳化后使有机相和水相分层困难，出现两种夹带： ①发酵液中夹带有机溶剂微滴，使目标产物受到损失； ②有机溶剂中夹带发酵液给后处理操作带来困难。
影响因素：表面活性剂的种类，浓度影响表面张力，介质黏度：较大时能增强保护膜的机械强度。液滴带电：相同电荷的颗粒互相排斥而维持乳浊液稳定。
如何消除：P101在操作前，对发酵液进行过滤或絮凝沉淀处理，可除去大部分蛋白质及固体微粒，防止乳化现象的发生。 乳化产生后，采取适当的破乳手段——
物理方法：过滤或离心沉降——乳化现象不严重，可采用的方法。
加热
稀释
吸附
加电解质 化学方法：
对于O/W型乳浊液，加入亲油性表面活性剂，可使乳浊液从O/W型转变成W/O型， 对于W/O型乳浊液，加入亲水性表面活性剂，如SDS（十二烷基磺酸钠）或PPB（溴代十五烷基砒碇）可达到破乳的目的。
5.从分子相互作用的机理出发，理解两水相体系的形成。
当两种大分子物质相混合时，其混合结果主要是由分子间作用力决定的。两种聚合物分子间若存在相互排斥作用，即某种分子的周围将聚集同种分子而非异种分子，达到平衡时，就可能形成两相，而两种聚合物分别进入一相中，形成双水相体系。 6.在两水相加入无机盐如何影响物质的分配？
在两水相中加入的无机盐盐析剂通过降低溶质在水中的溶解度，使其更易转入有机溶剂中，同时还可以减少有机溶剂在水中的溶解度来影响物质的分配。另外，盐析剂的加入还可以促进溶质的解离，提高分配系数。
7.影响生物分子在两水相中分配的因素有哪些？ （1）成相聚合物的相对分子质量 （2）聚合物的浓度 （3）盐的种类 （4）盐的浓度 （5）pH （6）温度 （7）细胞的浓度
离子交换法
1 理解概念：交换容量，工作交换容量，膨胀度，湿真密度，交联度 2 离子交换树脂如何命名？ 命名方法：
（1）凝胶型：分类代号-骨架代号-顺序代号-交联度 （2）大孔型：大孔（D）-分类代号-骨架代号-顺序代号
分类代号：0-强酸，1-弱酸，2-强碱，3-弱碱，4-螯合，5-两性，6-氧化还原。
骨架代号：0-苯乙烯系，1-苯烯酸系，2-酚醛，3-环氧，4-乙烯吡啶，5-脲醛，6-氧乙烯。
顺序代号：1-99 强酸，100-199 弱酸，200-299 强碱，300-399 弱碱。
例：D101：大孔弱酸苯乙烯系1号树脂。
离子交换树脂的全名由分类名称、骨架（或基团）名称、基本名称（离子交换树脂）排列组成。由于氧化还原树脂与离子交换树脂的特性不同，故在命名的排列上也有不同，其命名由基本名称、骨架名称、分类名称和树脂两字排列组成。凡属酸性的应在基本名称
前加一“阳”字；凡属碱性的，在基本名称前加一“阴”字。为了区别离子交换树脂产品中同一类中的不同品种，在全名前必须有符号，离子交换树脂的型号由三位阿拉伯数字组成。第1位数字代表产品的分类，第2位数字代表骨架结构的差异，第三位数字为顺序号，用以区别基团、交联剂等的不同。
为了区别凝胶型和大孔型离子交换树脂，在全名前加“大孔”两字或加“大”字的汉语拼音首字母“D”表示大孔型树脂。凝胶型离子交换树脂，在型号后面用“×”号连接阿拉伯数字，表示交联度。
3.离子交换树脂的分类？其主要的理化性质有哪些？
（一）按照交换的活性离子分类可分为 （1）强酸性阳离子树脂 （2）弱酸性阳离子树脂 （3）强碱性阴离子树脂 （4）弱碱性阴离子树脂 （5）两性离子交换树脂
（6）选择性离子交换树脂（螯合性） （7）电子交换树脂(氧化还原树脂)
（二）离子交换树脂按照树脂的物理结构分类分为：凝胶型树脂；大网格型树脂。 4.为何阴树脂交换容量用动态法测定而阳树脂用静态法测定？
5.离子交换树脂除了离子作用力外，可能还存在哪些作用力 除静电力外，还存在氢键和范德华力等辅助力。 6.大网格离子与凝胶离子交换树脂在结构上有何不同？ （1） 交联度（2） 孔径大，交换速度快，抗污染 （3）比表面大（4）永久孔隙度，可用非水溶液中交换 7.选择离子交换树脂与吸附条件时应当考虑因素？
层析
1.苯硼酸亲和介质用于分离哪些目标物？原理是什么?
2 道南效应对离子交换树脂产生怎样的影响?
3 凝胶层析分离机理是什么? 凝胶层析分离机理：利用凝胶粒子为固定相，依据筛分原理，根据料液中溶质分子的相对分子质量进行分离。
4 染料亲和层析的分子机制是什么?
电泳
1 理解概念：电泳迁移率，电渗，电泳，SDS-PAGE ， 双向电泳，等电聚焦。 电泳(electrophoresis): 在电场作用下，带电颗粒在溶液中的运动。 迁移率：单位电场强度下，粒子的泳动速度
电渗（electroosmosis）: 在电场作用下，液体对毛细管表面电荷作相对运动。 等电点聚焦
（Isoelectric focusing, IEF）
1 原理：利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的pH下呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离。
2 不连续电泳与连续电泳有何区别？
3 十二烷基硫酸钠（SDS）在SDS-聚丙烯酰胺电泳中起什么作用？
