《食品微生物检验技术》实验指导
1 《食品微生物检验技术》实验指导
一、课程性质和任务
《食品微生物检验学》是以微生物学的理论为基础，对食品的微生物污染及控制措施、以微生物为主的因素引起的食品腐败变质、食品检验样品的采集及处理作了扼要介绍；着重介绍了食品微生物检验的指标，食物中毒性微生物、常见病原微生物的生物学特性、致病性及检验方法；系统阐述了肉、蛋、乳、水产品及其制品、罐头食品的微生物学检验方法。通过本课程的学习，使学生掌握食品微生物检验的基本原理与方法，注重培养学生的实际操作能力。
二、教学的目标及要求
通过该课程的学习，要求学生掌握食品微生物检验的基本原理与方法，提高微生物检验的实际操作能力。为达到上述目标，要求学生一定要自己亲自动手独立实验，实事求是的完成每一次实验报告，并做好每次实验前的预习。
三、教学方式及课程考核办法
所有实验在教学实验室里由教师指导完成。课程结束后分笔试和操作考试，操作考试采取一个教师对一个学生的方式进行。考试内容由学生自己抽签选择其中一项在规定时间内完成，超过规定时间扣分。笔试成绩和操作成绩各占考试成绩的60％与40％。
实验一 食品样品的采集及处理
一．实验目的和要求
学习采集样品，稀释样品的方法与步骤。 二．实验原理
样品是指从某一总体中抽出的一部分，食品采样是指从较大批量食品中抽取能较好地代表其总体样品的方法。食品卫生监督部门或食品企业自身为了解和判断食品的营养与卫生质量，或查明食品在生产过程中的卫生状况，可使用采样检验的方法。根据抽样检验的结果，结合感官检查，可对食品的营养价值和卫生质量作出评价，或协助企业找出某些生产环节中存在的主要卫生问题。食品采样是 2 食品检测结果准确与否的关键，也是营养食品卫生专业人员必须掌握的一项基本技能。
三．需用的仪器或试剂等
培养基、试管、三角瓶、酒精灯、恒温恒湿培养箱。 四．采样方法步骤
（1）液体、半液体均匀食品： 采样以一池、一缸、一桶为一个采样单位，搅拌均匀后采集一份样品；若采样单位容量过大，可按高度等距离分上、中、下三层，在四角和中央的不同部位每层各取等量样品，混合后再采样；流动液体可定时定量从输出的管口取样，混合后再采样；大包装食品，如用铝桶、铁桶、塑料桶包装的液体、半液体食品，采样前需用采样管插人容器底部，将液体吸出放入透明的玻璃容器内作现场感官检查，然后将液体充分搅拌均匀，用长柄勺或采样管取样。
（2）固体散装食品：大量的散装固体食品，如粮食、油料种子、豆类、花生等，可采用几何法、分区分层法采样。几何法即把一堆物品视为一种几何立体（如立方体、圆锥体、圆柱体等），取样时首先把整堆物品设定或想象为若干体积相等的部分，从这些部分中各取出体积相等的样品混合为初级样品。对在粮堆、库房、船舱、车厢里堆积的食品进行采样，可采用分层采样法，即分上、中、下三层或等距离多层，在每层中心及四角分别采取等量小样，混合为初级样品；对数量较多的颗粒或粉末状固体食品，需用“四分法”采样。
（3）不均匀食品： 蔬菜、鱼、肉、蛋类等食品应根据检验目的和要求，从同一部位采集小样，或从具有代表性的各个部位采取小样，然后经过充分混合得到初级样品。肉类应从整体各部位取样（不包括骨及毛发）；鱼类，大鱼从头、体、尾各部位取样，小鱼可取2～3条；蔬菜，如葱、菠菜等可取整棵，莲白、青莱等可从中心剖开成二或四个对称部分，取其中一个或两个对称部分；蛋类，可按一定个数取样，也可根据检验目的将蛋黄、蛋清分开取样。 五．样品处理
稀释样品。称取1g样品，在火焰旁加到有9mL无菌水和少许玻璃珠的三角瓶 3 内，振荡10min，使样品和水样充分混合，将菌分散，样品中的菌样被稀释了100倍，样品悬液的稀释度为10-2。在火焰处打开无菌吸管的纸套，用无菌吸管吸取样品悬液1ml，加到一个盛有9ml无菌水的试管内，稀释1000倍制成稀释度为10-3的检样悬液，将此吸管在试管内反复吹洗3次，然后取出，通过火焰，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液均匀。再用刚才用过的吸管，插入试管内，反复吹洗3次，然后取出1ml菌液，加到另一支9 ml无菌水中，制成稀释度为10-4的样品悬液备培养基平板
同法按每级稀释10倍的次序得到10-
5、10-6的样品稀释液，稀释完后，用最后一支吸管，由最小的稀释液（10-6）开始吸取0.2ml加到编号为10-6的培养皿，再依次分别从10-
5、10-4试管中各吸取0.2ml稀释液，加到相应编号的培养皿内，每次吸取时，吸管都要在稀释液中反复吹洗几次。
实验二 细菌的革兰氏染色
1．本次实验的目的和要求
进一步掌握正确规范使用显微镜的方法和技能。理解简单染色和革兰氏染色的原理。掌握革兰氏染色的方法与规范操作。巩固显微镜的使用方法和无菌操作技术。
2．实验内容或原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的 4 脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
3．需用的仪器或试剂等
显微镜，擦镜纸，香柏油，二甲苯，接种环，酒精灯，石炭酸复红染色液，草酸胺结晶紫染色液，95%乙醇，蕃红染色液，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。 4．实验步骤 (1) 制片
取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。 要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 (2) 初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。 (3) 媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 (4) 脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 水洗时，不要直接 冲涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜急、过大，以免涂片薄膜脱落。
注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是格兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。 (5) 复染
用番红染液复染约2min，水洗。
5 (6) 镜检
干燥后，用油镜观察。
菌体被染成蓝紫色是革兰氏性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。
实验三 微生物培养基的制备
1 实验目的与要求：
(1) 学习微生物培养基的制备，了解培养基配方中各成分的作用、制备流程及各环节的操作技术与应用。
(2) 学习并掌握培养基的高压蒸气灭菌原理、操作关键技术和灭菌技术。 2 实验原理
(1) 培养基的制备原理
培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。它含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。
固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃～37℃)不会融化而保持固体状态。 （2） 高压蒸气灭菌原理
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达 6 到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 3 实验器材
琼脂、10％HCL、10% NaOH、牛肉膏、蛋白胨、试管、量筒、小烧杯、玻璃棒、骨匙、pH试纸、纱布、棉花、报纸、麻绳、标签、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、电炉等。 4 实验步骤
(1) 称量：按照培养基配方，准确称取各成份放于烧杯中。
(2) 熔化：向上述烧杯中加入所需水量，搅匀，然后加热使其熔解。如是配制固体培养基，在琼脂熔化的过程中，需不断搅拌并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全熔解后，补充所失水分。如果配方中含有淀粉，则需要将淀粉用少量冷水调成糊状并在火焰上加热搅拌后加足水份及其他药品，待完全熔解后，补充水份。
(3) 调PH值：初制备好的培养基往往不能符合所要求的PH值，故需用PH试纸或酸度计校正，用1M HCl调PH至所需范围。
(4) 过滤：用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求的情况下这一步可以省去。 (5) 分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。
注意：装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。
7 (6) 高压灭菌
手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：
a 首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
b 放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
c 加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
d 同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制电源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟灭菌。
e 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
f 将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。
实验四 微生物菌种的分离纯化
1 实验目的和要求
学习采集样品，分离纯化微生物菌种的方法步骤 2 实验内容或原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种微生物的过程称为微生物的分离纯化。欲从含有多种微生物的样品中直接辩认出，并且取得某种所需微生物的个体，进行纯培养，那是困难的。由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成，菌落又是可以识别和加以鉴定的。因此将样品中不同微生物 8 个体在特定的培养基上培养出不同单一菌落，再从选定的某一菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯化的目的。这也就是常用纯种分离法的原理。
3 需用的仪器或试剂等
培养基、试管、培养皿、三角瓶、接种环、酒精灯、恒温恒湿培养箱。 4 实验步骤 (1) 采样，样品稀释
稀释土样。称取1g样品，在火焰旁加到有99mL无菌水和少许玻璃珠的三角瓶内，振荡10min，使土壤和水样充分混合，将菌分散，土样中的菌样被稀释了100倍，土壤悬液的稀释度为10-2。在火焰处打开无菌吸管的纸套，用无菌吸管吸取土壤悬液1ml，加到一个盛有9ml无菌水的试管内，稀释1000倍制成稀释度为10-3的土壤悬液，将此吸管在试管内反复吹洗3次，然后取出，通过火焰，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液均匀。再用刚才用过的吸管，插入试管内，反复吹洗3次，然后取出1ml菌液，加到另一支9 ml无菌水中，制成稀释度为10-4的土壤悬液备培养基平板
同法按每级稀释10倍的次序得到10-
5、10-6的土壤稀释液，稀释完后，用最后一支吸管，由最小的稀释液（10-6）开始吸取0.2ml加到编号为10-6的培养皿，再依次分别从10-
5、10-4试管中各吸取0.2ml稀释液，加到相应编号的培养皿内，每次吸取时，吸管都要在稀释液中反复吹洗几次。 (2) 制备培养基平板 (3)平板画线法分离培养
a平板的制作及培养。将已灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基水浴融化后冷却至45℃～50℃（温度过高，培养皿盖上凝结水太多，菌易被冲掉或烫死；温度过低，培养基凝固不易倒出）。
倾倒培养基应在酒精灯火焰附近操作，右手持盛培养基的三角瓶（或试管），左手拿培养皿，并松动三角瓶的棉塞。培养基一次不能用完时，棉塞应用左手小指夹持，不可放在桌面上，拔出棉塞后，三角瓶口在火焰上灭菌，然后少许打开 9 培养皿盖，迅速倾入培养基，迅速将皿盖盖妥，平放桌上，轻轻旋转，使培养基与悬液混合均匀，待凝固后，即成平板。将培养皿倒置于37℃恒温箱中培养24h，细菌即在所固定的位置长成肉眼可见的菌落。
放线菌的稀释分离法同前，只不过在制土壤悬液时，于99ml无菌水的三角瓶内加入10%的苯酚溶液10滴，以抑制细菌生长，28℃恒温箱中培养7 d～10d。
b平板划线分离法
将融化的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制成平板，待冷凝后，左手持平板，右手持接种针，用接种环在火焰上灭菌后沾取一环适宜稀释度的悬液，在火焰附近用左手拇指、食指掀开皿盖，使接种环轻触培养基，迅速划线（注意勿将培养基划破），划线时，接种环与培养基表面的夹角为20～30°。
常用的划线方式有两种,一种是将平板分成三个区域，先在第一个区域内划3～4条平行线，转动培养皿，在火焰上烧掉接种环上的残余物后，通过第一次划线部分，在第二个区域内划线；第二个区域中的线和第一个区域中的线应有部分交叉，依法在第三个区域中划线。另一种是先以沾有细菌悬液的接种环在平板的一端抹一下，使该处沾上一些细菌，然后烧掉环上剩下的细菌，再用烧过冷却的接种环，通过刚才涂抹的部分，左右划线，不能互相接触。
划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法。分离纯化工作可反复进行，直至获得满意的单菌落纯培养为止。 （4）观察、镜检、纯培养
实验五 食品中菌落总数的测定
1 实验目的和要求
掌握菌落计数的方法，掌握食品细菌菌落总数的测定报告方式。 2 实验内容或原理
菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态过程，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
10 菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数也并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 3 实验材料与仪器
食品检样、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、无菌生理盐水、无菌培养皿、无菌移液管、无菌不锈钢勺。 4 实验步骤
（1）取样、稀释和培养
a 以无菌操作取检样25g（或ml），放于225ml灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠），经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
b 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
c 另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10ml吸管。
d 根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
e 稀释液移入平皿后，将凉至45℃～50℃牛肉膏蛋白胨琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
f 待培养基凝固后，翻转平板，置37℃温箱内培养48h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 (2) 菌落计数方法
作平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0℃～4℃，但不要超过24h。 (3) 菌落计数报告方法
a平皿菌落数的选择
11 选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。
b 稀释度的选择
① 应选取平均菌落数在30～300之间的稀释度报告
细菌菌落总数是指检样在培养基上37℃24小时培养所长出的菌落数。菌落总数的多少可以说明污染的程度。
② 若有二个稀释度均在30～300之间时，应以二者比值决定，比值 ≤2取平均数，比值>2则其较小数字。
③ 若所有稀释度均>300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数。 ④ 若所有稀释度均300，有的又
c 菌落计数报告方法
菌落数在1～100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。
实验六 食品中大肠菌群的测定
1．实验目的和要求
学习食品中大肠菌群检测程序方法，掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。
2．实验内容或原理
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
12 食品中大肠菌群数是以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。本实验学习多管发酵法检测食品中的大肠菌群。
a 初发酵试验
用于初步发酵试验的液体培养基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。许多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群可发酵乳糖产酸（有机酸），产气（CO2+H2）。乳糖起选择性碳源的作用。溴甲酚紫是pH指示剂（碱性条件：紫兰色；酸性条件：黄色，变色点pH=6.7），当大肠菌群的细菌利用乳糖产酸后，使原来的pH由中性下降成酸性，培养基从紫色变为黄色。另外，溴甲酚紫还具有抑制其他细菌生长的作用。
b平板分离
为进一步证明大肠菌群的存在，需进行平板分离，所用培养基为伊红美蓝琼脂。伊红美蓝琼脂培养基中含有伊红与美蓝两种苯胺类染料，可以抑制G+菌和一些难培养的G-菌，而且在低酸度时，两种染料结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。大肠菌群因其强烈发酵乳糖而产生大量混合酸，使菌体表面带上正电荷，可染上伊红染液，伊红与美蓝结合，菌体被着上深紫色，形成带核心、具金属光泽的特征性菌落。
c 复发酵试验
阳性菌落经涂片染色鉴别为G-，无芽孢者，再经过乳糖发酵管液体培养进行复发酵试验，经24h培养产酸产气者，可确认为大肠菌群阳性结果。 3 实验材料与仪器
食品检样、乳糖蛋白胨发酵管、伊红美蓝琼脂平板、EC 肉汤、磷酸盐缓冲稀释液、蛋白胨稀释液、无菌生理盐水、革兰氏染色液、恒温箱、冰箱、恒温水浴、天平、显微镜、直径为90mm的平皿、试管、吸管、广口瓶或三角烧瓶、玻璃珠、载玻片、酒精灯、试管架。 4 实验操作步骤 （1） 检样处理
液态检样可用振摇的方式，使充分均匀混合后，取50ml加入 450ml已灭菌的稀释液中，即为10倍稀释检液。
13 凝态及浓稠液态检体如布丁、炼乳等,经适当搅拌均匀后，取50g加入450ml灭菌之稀释液中，用搅拌均质器搅拌(搅拌方法同前)，即为10倍稀释检液。 （2） 检样稀释
以无菌操作将上述处理样25ml放于有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇后，制成1:10的均匀稀释液。
用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，制成1:100的稀释液。
另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌吸管。
根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种3管。 （3） 初发酵试验
将已选择的稀释检液及原液(液体检样)充分振摇、混合均匀后,分别吸取1ml接种于已装有9ml乳糖胆盐发酵管内（内倒置小管）。接种量在1ml以上者，用双倍乳糖胆盐发酵管（内倒置小管），1ml及1ml以下者，用单倍乳糖胆盐发酵管（内倒置小管）。每一稀释度接种3管，置37℃ 温箱内，培养24h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
（4） 分离培养
经24h培养后，将产气（倒管顶部有空气）的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置37℃ 温箱内，培养24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。 （5） 复发酵试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置 37℃温箱内培养24h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
