内蒙古师范大学体育学院
本科学生毕业论文
论文题目： 姓 名： 学 号： 系 别： 专 业： 指导教师： 李旭辉 副教授
目 录 几丁聚糖对力竭游泳小鼠红细胞自由基代谢的影响
姓名 000000 学号0000000
指导教师：000000
摘要
目的： 探讨补充4周几丁聚糖对一次力竭运动小鼠红细胞自由基代谢及ATP酶活性的影响。方法：昆明系小鼠36只随机分为安静组、力竭组、药物组，每组12只。药物组补充几丁聚糖，每日按0.33g /kg体重的剂量灌胃，补充4周以后力竭组和药物组进行力竭游泳测试，记录游泳至力竭时间，测定红细胞MDA含量、SOD、GPH-Px、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。结果: 药物组小鼠游泳至力竭时间明显延长；力竭运动后力竭组小鼠红细胞MDA含量显著高于安静组，红细胞SOD、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著低于安静组；药物组力竭运动后红细胞MDA含量显著低于力竭组，红细胞SOD、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著高于力竭组；三组间GSH-Px活性均无显著性差异。结论: 补充几丁聚糖能明显降低力竭运动导致的红细胞自由基过氧化损伤、提高红细胞抗氧化酶活性、抵抗力竭运动导致的红细胞ATP酶功能下降，并且可以延长小鼠游泳至力竭时间。
关键词
几丁聚糖; 力竭运动; 红细胞 ;自由基; ATP酶
几丁聚糖（Chitosan）是一种存在于海洋节肢动物外壳，菌类、昆虫类、藻类细胞膜和高等植物的细胞壁之中的天然氨基多糖，于1991年被欧美日的营养学家誉为生命的“第六要素”，也是迄今为止自然界中唯一被发现的可食用阳离子动物纤维。几丁聚糖作为一种具有特殊生理功能的营养物质，以往研究主要集中在提高机体免疫能力方面，在近年，临床及
[1-3]药学方面也报道几丁聚糖具有清除自由基的功能， 但几丁聚糖在运动领域的研究报道很
[4]少，朱柯曾报道补充几丁聚糖具有提高运动员安静及大强度以后红细胞的免疫能力，但关于几丁聚糖对力竭运动红细胞自由基代谢的影响未见报道。鉴此,本实验建立一次性力竭运动动物模型，全面探讨补充几丁聚糖对红细胞自由基代谢、ATP酶活性以及小鼠运动能力的影响，为几丁聚糖应用于抗运动疲劳开发提供实验依据。
1 材料与方法 1.1材料
雄性昆明系（KM）小鼠36只，5周龄，体重18－23克，由中国医科大学第二附属医院动物中心购入，常规分笼喂养，自由饮水和摄入基础饲料，环境温度20－25℃，相对湿度50~60%每天通风换气，每两周消毒一次。
几丁聚糖为日本三荣工业株式会社产品“救多善”，其几丁聚糖含量为93.66%，由日本海红蟹脚壳提取的几丁质脱乙酰而成。 1.2 分组及给药
适应性饲养一周后随机分为3组，每组12只：安静组：常规安静饲养，每天按0.1ml/10g体重的量灌胃给温开水一次，持续四周。力竭组：常规安静饲养，每天按0.1ml/10g体重的量灌胃给温开水一次，持续四周。药物组：常规安静饲养，灌胃法补充几丁聚糖，几丁聚糖量为每天0.33g /kg体重，按体重称取几丁聚糖后溶解于0.1ml/kg体重的温开水中, 持续灌服四周。四周后在进行力竭游泳实验时力竭组和药物组各有一只小鼠在力竭游泳出水后死亡，无法取血测定，为了便于统计处理，安静组也随机去掉一只，最后测试样本每组为11只。
1.3 力竭游泳测试方法 饲养四周后，力竭组和药物组小鼠做一次力竭游泳实验。水温32士2℃，水深45cm，记录小鼠游泳至力竭时间，力竭判断的标准为:小鼠头下沉10秒不上浮，放在平面上无法完成翻正反射。 1.4取材
力竭后小鼠摘眼球取血，肝素抗凝。 1.5 红细胞MDA测定
红细胞MDA抽提液的制备：取肝素抗凝血150ul，加入3ml的生理盐水，1500转/分 离心5分钟，弃上清液，留沉淀的红细胞，加入蒸馏水0.6ml，再漩涡混匀器上混匀1分钟使红细胞溶解，加入95％的乙醇0.3ml放置于漩涡混匀器充分混匀30秒，，再加入三氯甲烷0.3ml放置于漩涡混匀器充分混匀一分钟， 3500转/分 离心8分钟取上清液即为红细胞MDA提抽液。取0.8ml红细胞MDA提抽液用亚硝酸盐还原法测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.6 红细胞SOD测定
红细胞SOD提抽液制备：取肝素抗凝全血50ul，冲入注有3ml的生理盐水中，2000转/分 离心3分钟，吸干净上清液，留沉淀的红细胞，加入冰蒸馏水0.2ml，混匀使红细胞溶解，加入95％的乙醇0.1ml振荡30秒，再加入三氯甲烷0.1ml放置于漩涡混匀器充分混匀一分钟， 3500转/分 离心8分钟取上清液即为红细胞SOD提抽液。取10ul红细胞SOD提抽液用硫代巴比妥酸比色法测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。 1.7 红细胞GSH-Px测定
【】制备红细胞GSH-Px测定液25 ：取肝素抗凝血50ul，生理盐水洗涤3次，弃上清液留沉淀的红细胞，加入蒸馏水0.95ml，再漩涡混匀器上混匀1分钟使红细胞充分溶血，即为红细胞GSH-Px测定液。然后取0.2ml红细胞GSH-Px测定液用硫代硝基苯甲酸比色法测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.8 红细胞Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶测定
定磷法，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.9 统计学处理
所有实验数据用SPSS11.5软件包处理，结果用均数±标准差表示，组间样本均数差异显著性用t检验进行检验，P
2.1不同组别小鼠红细胞MDA含量、SOD、GSH-Px活性的比较（见表1）
表1显示：力竭组小鼠红细胞MDA含量显著高于安静组（p0.05)，但与安静组比较，力竭运动组出现了下降的趋势，而药物组与力竭组相比有升高的趋势。
表1 力竭游泳后各组小鼠MDA含量、SOD、GSH-Px活性的比较
组别
n
MDA
SOD
GSH-Px
（nmol/gHb）
（U/gHb）
(U／gHb) 安静组
41.37±3.92
19520.28±1111.35
6491.72±297.58 力竭组
45.96±3.03＊
18079.06±1117.08＊
6233.99±439.20 药物组
42.40± 3.81△
19131.29±1039.77 △
6451.16±424.68 ＊p
△ p
2.2 不同组别小鼠红细胞Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的比较（见表2）
表2显示力竭组小鼠红细胞Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著低于安静组（p
表2 力竭游泳后各组小鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的比较
组别
n
Na+-K+-ATP
Ca2+-Mg2+-ATP
（umolPi/gHb/h）
（umolPi/gHb/h） 安静组
14.21±2.27
14.95±2.83 力竭组
11.66±1.57＊
11.50±2.43＊ 药物组
13.91±2.27△
14.20±2.88△
＊ p
△p
2.3 力竭组和药物组游泳至力竭时间的比较
药物组小鼠游泳至力竭时间为184.53±23.85分钟，明显长于力竭组的158.21±18.99分钟（p
3 讨论
3.1 几丁聚糖对力竭运动小鼠红细胞自由基代谢的影响
几丁聚糖（Chitosan）又称脱乙酰甲壳素、壳聚糖， 它是一种维持、保护甲壳动物和
【】微生物躯体的天然氨基多糖。几丁聚糖的基本结构单位是葡萄糖胺。研究报道5几丁聚糖具有清除自由基、中和体内酸性代谢产物、提高机体免疫力等多种生理活性。本实验发现，一次力竭游泳后，与安静组相比，力竭组小鼠红细胞MDA含量显著升高，而SOD活性明显下降，GSH-Px活性有下降趋势；而补充几丁聚糖的服药组红细胞MDA含量明显低于力竭组，同时药物组红细胞SOD活性明显高于力竭组、GSH-Px活性有升高趋势 ，这提示4周补充几丁聚糖可以减轻力竭运动过程中自由基对红细胞的过氧化损害，提高小鼠体内抗氧化酶活性，尤其是抗氧化酶系中的SOD活性。本文推测几丁聚糖抗氧化作用可能与几丁聚糖的特殊结构和特殊生物活性有关：几丁聚糖分子结构具有活性基团氨基，该基团可以直接与自由基发生反应，消除体内自由基，几丁聚糖还具有较强的细胞亲和性及阳离子性，可以与红细胞相互作用，在红细胞膜表面形成一层糖屏障，保护膜结构的完整性，防止红细胞受到自由基的损伤；另外，有研究也表明，持续服用几丁聚糖也可以激活机体内的抗氧化酶活，性[67 ]。所以，几丁聚糖可能通过以上几种途径减轻力竭运动过程中自由基对红细胞的过氧化损害，使药物组的红细胞MDA含量下降，同时使红细胞抗氧化酶活性维持在较高水平。
＋＋3.2 几丁聚糖对力竭运动小鼠红细胞Na-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2-ATP酶活性的影响
＋＋红细胞Na-K+-ATP酶Ca2+-Mg2-ATP酶是存在与红细胞膜上的两种重要功能性蛋白酶，它们在氧气运输、能量转换、信息传递以及维持细胞内外离子平衡方面具有重要的作用。这两种酶活力的变化可以在一定程度上反映红细胞的功能状态 。本实验发现，力竭运动后，＋＋＋力竭组红细胞 Na-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2-ATP活性显著下降，而药物组红细胞Na-K+-ATP＋＋酶和Ca2+-Mg2-ATP活性显著高于力竭组。本文认为，力竭性运动后红细胞Na-K+-ATP酶＋和Ca2+-Mg2-ATP酶活性下降可能与自由基攻击红细胞膜导致的氧化损伤有关。 红细胞氧化损伤后膜脂肪链断裂交联、蛋白质交联变性、变性珠蛋白沉积于膜上，结果导致红细胞膜
＋＋结构发生改变，膜流动性下降，即Na-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2-ATP酶所在的脂质微环境发
＋＋生了变化，继发性引起N a-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2-ATP酶的活性下降，而几丁聚糖可能通
＋过阻止红细胞脂质过氧化反应维持红细胞膜的正常功能，防止力竭运动导致的红细胞Na＋-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2-ATP酶活性的下降。本研究结果初步表明，几丁聚糖具有阻止力竭运动过程中自由基对红细胞的过氧化损伤、维持红细胞正常功能的作用。
3.3 几丁聚糖对小鼠游泳至力竭时间的影响
本实验结果显示药物组小鼠游泳至力竭时间为184.53士23.85分钟， 而力竭组游泳至力竭时间为158.21士18.99分钟，差异具有显著性（p
4周补充几丁聚糖能明显降低力竭运动导致的红细胞自由基过氧化损伤、提高红细胞抗氧化酶活性、抵抗力竭运动导致的红细胞ATP酶功能下降，并且可以延长小鼠游泳至力竭时间， 这提示几丁聚糖在延缓运动疲劳方面具有一定的作用。
5 参考文献
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