实验一显微镜使用与细菌染色法
一、实验目的
1．学习掌握显微镜的结构、功能和使用方法。 2．学习掌握细菌简单染色和革兰氏染色方法。
二、显微镜的结构与功能 1．显微镜的结构
显微镜有机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置主要作用是使光学系统， 紧固在一个光轴直线上，而且可精确地调节各光学系统部件之间的距离，使显微镜产
生清晰的物象。其组成包括：①镜座和镜臂；②镜筒；③物镜转换器；④载物台；⑤调焦装置（粗调节器和细调节器）。光学系统使显微镜最主要地部分，起分辨和放大目的物地作用。其组成包括：①目镜；②物镜；③集光器；④反光镜；⑤光源（自然光源和电光源）。
光学显微镜基本结构：
1.照明灯(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.载物台和切片夹(Mechanical stage and specimenretainer)4.推进器(Mechanicalstage adjustment knob)5.物镜(Objectives) 6.粗细螺旋(Course andfine focus knob)7.目镜(Oculars)8.照相机等接口(Connection to camera, etc.) 2．显微镜的成像原理
标本得到足够的照明由标本反射或折射出的光线经物镜进入使光轴与水平面倾 斜45 度的棱镜，在目镜的焦平面上，即在目镜的视场光阑处，成放大的侧光实像，该实像在经目镜的接目透镜放大成虚像，所以人们看到的实虚像。 3．分辨力与数值孔径
显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆 盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。 1． 数值孔径
数值孔径（又称开口率numerical aperture 简写NA）是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。 数值孔径是光线投射到物镜上的最大开口角度一半的正弦，乘上标本与物镜间介质的折射率的乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2 成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想增大NA 值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n 值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n 值大于1，NA 值就能大于1。 2． 分辨率
显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，。其计算公式 是σ = λ/NA 式中σ 为最小分辨距离；λ 为光线的波长；NA 为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA 值与照明光源的波长两个因素决定。NA 值越大，照明光线波长越短，则σ 值越小，分辨率就越高。 要提高分辨率，即减小σ 值，可采取以下措施
（1） 降低波长λ 值，使用短波长光源。（2） 增大介质n 值以提高NA 值（NA=nsinu/2）。（3） 增大孔径角u 值以提高NA 值。（4） 增加明暗反差。 3． 放大率和有效放大率
由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率应该是物镜放大率和目 镜放大率的乘积。显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。 4．镜头的识别
低倍、高倍和油镜接物镜的识别方法，可直接读它上面刻的倍数，简便方法是低 倍镜较短，高倍镜较长，油镜更长且上面刻有黑圈。使用时一定要识别清楚，不可认错，否则在转换物镜时会碰压镜头，损坏物镜的危险。放大倍数越高的接物镜它的焦距越小，工作距离也越小，因此油镜观察时镜头和玻片极为接近，使用时应该注意。
三、实验方法
1．用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作简单染色： 涂片→干燥→固定→染色→镜检
（1）涂片：在玻片中央滴一滴蒸馏水，然后取菌少许，洗入蒸馏水滴中，做成薄薄一层。
（2）干燥：细菌涂片一般应让他自然风干。有时为使它干得快些，可以把涂片小心在酒精灯火焰上微微加热烘干。
（3）固定：细菌涂片常用火焰固定法。即将涂片不快不慢地在火焰上通过2-3 次，菌体受热固着于玻片上。
（4）染色：细菌简单染色常用石炭酸复红或草酸铵结晶紫为染色剂。在已固定的涂片上加一大滴石炭酸复红染色液，使盖住整个涂抹面，静置染色1 分钟。 （5）水洗：染色完毕用自来水把玻片上的染色液冲洗干净。
（6）镜检：将染色片晾干，或用吸水纸把多余的水吸去晾干，再用显微镜观察。 2．用大肠杆菌(E.coli)和金色葡萄球菌(staphylococcua aureus)作革兰氏染色: 染色方法的要点及原理：先用结晶紫染色，再加碘液固定，酒精处理后用番红复 染。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
染色的具体步骤：涂片→固定→初染→媒染→脱色→复染→镜检 （1）取菌按常法涂片、干燥、固定。 （2）草酸铵结晶紫染色1 分钟。 （3）充分水洗后加碘液处理1 分钟。
（4）水洗后酒精脱色15-20 秒。（用酒精连续滴洗，至不溶出颜色为止）。 （5）水洗后加番红染色1 分钟。
（6）充分水洗，吸去余水后晾干，镜检。
四、作业
1．画出你在油镜下观察到的细菌形态并注明放大倍数？ 2．在染色中，固定一步起何作用？酒精脱色一步为何是关键？ 3．用油镜观察应注意哪些问题？滴加香柏油起什么作用？ 4．油镜使用完后应如何处理？
实验二放线菌与霉菌形态观察
一、实验目的
1．学习掌握插片法和水浸片法观察放线菌和霉菌的方法。 2．学习掌握低倍镜和高倍镜观察丝状菌体的技能。
二、实验内容
1．用插片法观察绘图放线菌的形态并注意“三丝”分化。将灭菌的盖玻片斜插在涂布放线菌孢子的培养基的平板上，一半露在外面，恒温培养后在培养基表面和盖玻片上部都有放线菌生长，小心取出盖玻片，放在干净的载玻片上，在显微镜下直接观察。
2．用水浸片法观察：青霉（Penicillium.sp）、曲霉（Aspergillus.sp）的形态和分生孢子。 根霉（Rhigopus.sp）的假根和孢囊孢子。 梨头霉（Absidia.sp）的接合孢子，木霉（Trichederma.sp）的形态，注意分枝形态。
霉菌菌丝一般可从培养体上直接调取，作成水浸片。具体方法：在清洁载玻片中央，加蒸馏水一滴，用解针挑取少量菌丝放入水滴中，这时两手各持针一支，将菌丝分开，不使缠结成团。挑开菌丝后，轻轻加上盖玻片，注意不要产生气泡，先用低倍镜后用高倍镜观察。
三、作业
1．绘图、记录南昌链霉菌、青霉、木霉、曲霉和根霉的形态。 2．绘图、记录梨头霉的接合孢子形态。 3．用水浸片法观察丝状真菌应注意哪些事项？
实验三污水环境细菌运动性与原生动物、藻类的形态观察
一、实验目的
1．学习掌握用悬滴法观察细菌运动性的方法和技术。 2．学习掌握用水浸片法观察原生动物和藻类的形态。
二、实验内容
1．用悬滴法观察污水中细菌的运动性，注意运动方向。 2．用水浸片法观察原生动物的形态、运动性并注意分类。 （1） 鞭毛虫类（Flagellata）：绿眼虫、波豆虫 （2） 肉足虫类（Sarcoclina）：变形虫、太阳虫
（3） 纤毛虫（Ciliata）：草虫、肾形虫、钟虫、豆形虫、漫游虫等 3．用水浸片法观察藻类的形态、种类并注意分类。 （1） 绿藻：空球藻属（Fudoria） 珊藻属（Scendesmus） 鼓藻属（Cosmarium） 小球藻属（Chlorella） 盘星藻属（Pediastrum）
（2） 裸藻：眼虫藻属（Euglena） （3） 硅藻：舟形藻属（Navicula） 直链藻属（Melosira）平板藻属（Tabellaria）
三、作业
1．绘图记录细菌的运动方向，悬滴法观察应注意哪些事项？ 2．绘图记录原生动物、藻类的形态、种类和名称。
实验四 微生物的大小测定与数量的测定
一、实验目的
1．学习了解测微尺的结构，掌握测定微生物大小的方法。 2．观察酵母菌的形态，掌握鉴别死活酵母菌的方法。
3．学习了解血球计数板的结构，掌握微生物数量测定的方法。
二、实验内容
1．在低倍镜和高倍镜下求出目镜测微尺的校正值。 （1） 目镜测微尺和镜台测微尺
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片的中央刻有一小尺，它是在5 毫米内作50 等分刻制的，每一等份为0.1 毫米。另一规格是5 毫米作100 等分，每等分为0.05 毫米。镜台测微尺是刻在载玻片中央的小尺，它是在1 毫米内作100 等分刻成的，每等分10 微米。
（2） 目镜测微尺校正的方法
将镜台测微尺上面的透镜片取下，把目镜测微尺放在光阑上，刻度朝下。把镜台 测微尺置于载物台上，用低倍物镜检视，使测微尺位于视野中央。注意区分视野内两把尺哪个是目镜测微尺，哪个是镜台测微尺。利用推进器或转动目镜使两尺的第一条线（0 线）互相重合，然后找出另一条重合线。如重合线较多选取距0 线最远的重合线。记下两条重合线之间两尺的刻度，依公式算出目镜测微尺的校正值。目镜测微尺校正值（每刻度微米数）= 两重叠刻度间镜台测微尺格数×10 两重叠刻度间目镜测微尺格数
2．用美兰水浸片法观察酿酒酵母（saccharomyces cerevisiac）的形态，注意出芽繁殖
和死活酵母菌的染色形态，并测量大小。 3．用血球板计算黑曲霉孢子的数量。 （1） 血球计数板
利用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。因为计 数板载片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。血球计数板是一只特制载玻片。载片上有两个方格网，每一方 格网共分九个大方格，其中间的一个大方格用来做微生物计数，所以又称为计数室。计数室的刻度一般有两种，一种是每个大方格分成16 个中方格，每中方格又分成25个小方格。另一种是一个大方格分25 个中方格，每个中方格又分成16 个小方格，不论哪一种，一个大方格，都等分成（25×16 或16×25）400 个小方格。因为每个大方格边长为1 毫米，载片与盖片间距离为0.1 毫米，所以每个计数室（1 个大方格）体积为0.1 立方毫米。测出每个中方格菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推算出1 毫升菌液内所含的菌数。一个大方格是16 个中方格时，应当数4 角4 个中方格（即100 个小方格）的菌数，一个大方格是25 个中方格时，除取4 角4 个中方格外，还要数中央一个中方格（即为80 个小方格）的菌数。计算公式如下： 16×25 计数板：
总菌数/ml= ×400×10000×稀释倍数=每个小方格内菌数×4×106×稀释倍数 25×16 计数板：
总菌数/ml= ×400×10000×稀释倍数=每小方格内菌数×4×106×稀释倍数 （2）血球计数板计数方法
①视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数为度。 ②取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
③将黑曲霉孢子悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
④静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
⑤计数时若计数区是由16 个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4 个大方格（即100 小格）的菌数。如果是25 个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l 个大方格的菌数（即80 个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
⑥测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
三、作业
1．测量酵母菌的大小（高倍镜）： 菌名 宽（目镜格数） 长（目镜格数）平均
2．在不改变目镜和目尺，而改变物镜来测定同一酵母菌时，其结果是否相同，为什么？
3．根据你的操作，用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？
实验五 培养基的制备与灭菌
一、实验目的
1．学习掌握培养基的制备原理与方法。 2．学习掌握玻璃器皿的包扎与灭菌方法。
3．学习掌握高压蒸汽灭菌，干热灭菌的原理与方法。
二、实验内容 1．玻璃器皿的包扎
（1） 每4-5 人为一组包扎：直径9 厘米培养皿3 包，每包6 皿，1ml 吸管2 支，5ml吸管2 支，玻璃刮铲3 支。
（2） 每一小组制备18×180mm 试管无菌水5 支，每支4.5ml 自来水，250ml 三角瓶带玻璃珠无菌水1 瓶，装自来水45ml，以上塞好棉塞包扎后待灭菌。 2．培养基制备
（1）培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 （2）制备流程：称量→溶解→蒸煮→调pH→分装→包扎→灭菌 （3）高氏一号培养基配方
可溶性淀粉 20g K2HPO4 0.5g KNO3 1g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 10mg 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 值 7.2—7.4 （4）每小组制备高氏培养基250ml，分装15*150mm 试管8-10 支，余液分装250ml 三角瓶2 瓶，塞棉塞包扎待灭菌。 （5）关键步骤及注意事项 ①要严格按配方配制。 ②调pH 不要过头。
③干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC 以下放物、取物。
④高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 3．消毒（disinfection）与灭菌（sterilization） 消毒：用化学或物理的方法杀死微生物的营养体。 灭菌：用物理或化学的方法杀灭物体上一切微生物。
（1）干热灭菌法：把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160ºC，恒温1 小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。
（2）高压蒸汽灭菌法（一般121ºC，30min，适用培养基）：把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055 公斤/厘米2 时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121ºC。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在15-20 分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。
（3）间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1 次，每次煮沸1h，连续3d 重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37ºC 恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。
（4）巴氏灭菌法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62ºC，30 分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。 4．棉塞的制作
三、作业
1．高氏一号培养基属于何种性质培养基？有沉淀吗？为什么？
2．高压蒸汽灭菌的过程中，应注意哪些事项，最关键的因素是什么？为什么？
实验六 环境微生物的分离与生理鉴定实验
一、实验目的
1．学习掌握平板稀释法分离环境微生物的技术。 2．学习掌握微生物生理生化鉴别的基本方法。 3．学习掌握无菌操作技术。
二、实验内容 1．土壤微生物的分离
分离微生物是，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给 它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其他菌 种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。分离方法用稀释平板分离法，其最终目 的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，同时还可以测定分离的微生物 的数量。
（1）方法：将土样随机称取10g，加入至装有90 ml 无菌水带玻璃珠的三角 瓶中，旋转震荡30min，作逐级分离，逐级稀释见下图，用无菌吸管吸取不同稀 释度菌悬液0.1ml 涂布平板。 （2）稀释度选择：
①牛肉膏培养基：10 皿(稀释度10﹣4,10﹣5,10﹣6,三个重复,一个备用)； ②高氏一号培养基：10 皿(稀释度10﹣3,10﹣4,10﹣5,三个重复，一个备用)； ③真菌培养基：10 皿(稀释度10﹣3,10﹣4,10﹣5,三个重复,一个备用)；
2．用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种糖发酵培养基、石蕊牛乳培养基、蛋白 胨培养基和淀粉培养基作生理鉴别实验。 （1）糖发酵试验
各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可 以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应 来鉴别细菌。糖发酵是最常用的生化反应，存在于大多数细菌中。不同的细菌 在糖的分解能力上存在很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质(如 乳酸、丙酸、醋酸等)和气体(如二氧化碳、氢、甲烷等)，而有些细菌只产生酸 不产生气体。例如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，普通变形杆菌分解 葡萄糖产酸产气，但不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来判断。在培养基 中加入溴甲酚紫(pH5．2 为黄色，pH6．8 为紫色)，当发酵产酸时，使培养基由 紫色变为黄色。气体的产生可由发酵试管中倒置的德汉氏小管中有无气泡的出 现来验证。 （2）石蕊牛乳试验
牛乳中通常含有蔗糖、乳糖、蛋白质、酪素等成分。微生物对牛乳的利用主 要是指乳糖及酪蛋白的分解利用。牛乳中常加入石蕊作酸碱指示剂和氧化还原指 示剂。微生物对牛乳的利用可分三种情况：①酸凝固作用：微生物发酵乳糖后产 生许多酸，使石蕊变红，同时酸度很高时，可使牛乳凝固。②凝乳酶凝固作用： 某些微生物能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固作用在中性环境中 发生，通常这类微生物还具有水解蛋白质的能力，从而会产生一些碱性物质，是 石蕊变蓝。③胨化作用：酪蛋白被水解变得清亮而透明，胨化作用可以在酸性或 碱性条件下进行，并且一般石蕊色素还原脱色。 （3）产氨和产硫化氢试验
某些微生物具有脱氨酶，能使氨基酸在各种作用下脱去氨基而生成氨，氨的 产生可用红色石蕊试纸夹悬于培养试管的棉塞下检验，培养后试纸变蓝，即判为 产氨。
某些微生物能分解培养基中的含硫氨基酸生成硫化氢。可用醋酸铅试纸，接
20 种试验菌于培养液中，立即将试纸悬夹于棉塞下，纸条下端与液面接近，但不可 接触。如试纸变黑为正反应即产硫化氢。 （4）淀粉水解试验
某些微生物具有淀粉酶，可以使淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖，而另一些微生 物则没有这种特性。将试验菌在淀粉水解培养基的平板上划“+”接种。培养后打开皿盖，滴加碘液于培养基，轻轻旋转培养皿，使碘液铺满整个平板。因培养基内含淀粉，遇碘立即变兰，但如果供试菌能分解淀粉，则菌落周围淀粉已被水解，此时遇碘不变色，因而菌落外围出现无色透明圈。
三、培养基的配制 1．牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g NaCl 0.5g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 值 7.2—7.4 2．高氏一号培养基 可溶性淀粉 20g K2HPO4 0.5g KNO3 1g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 10mg 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 值 7.2—7.4 使用时加1%重铬酸钾溶液0.5ml/250ml 培养基。 3．马丁培养基 葡萄糖 10g 蛋白胨 5g KH2PO4 1g 琼脂 20g MgSO4.7H2O 0.5g 自然PH 值
蒸馏水 1000ml 煮溶后加1%孟加拉红3.3ml,搅匀。（8 磅即112℃灭 菌30min） 4．糖发酵培养基 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 葡萄糖 5 g 水 1000 ml PH 值 7.2-7.4 加溴甲酚紫1.6%的酒精溶液1ml（8 磅即112℃灭菌30min）
溴甲酚紫1.6%酒精溶液的配制：称溴甲酚紫1.6g 溶于50ml 酒精（95%），再加 入蒸馏水50ml，用滤纸过滤后用三角瓶装，放冰箱备用。 5．石蕊牛乳培养基
牛奶（1000g）→煮沸→离心（4500 转/分钟，5 分钟）→去脂→调PH 值 7.2→加入石蕊液使牛奶成兰色→分装15×150ml 试管→8 磅灭菌20 分钟。 石蕊液配制：称2.5g 石蕊，加50ml 蒸馏水研磨，研磨石蕊时，先加少许蒸馏水 研磨，研磨过程中慢慢滴加蒸馏水，研磨到无颗粒为止，再进行抽滤。 6.淀粉水解培养基 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 5 g 可溶性淀粉 5g 琼脂 20g 蒸馏水 1000 ml PH 值 7.2 7．产硫化氢培养基 蛋白胨 20g NaCl 5g 牛肉膏 2.5 g 柠檬酸铁铵 0.5g 硫代硫酸钠 0.5g 蒸馏水 1000 ml
三、作业
1．平板稀释分离环境微生物应注意哪些事项？ 2．生理鉴别试验的原理与反应有哪些？
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实验七 环境微生物分离与生理鉴定结果检查
一、实验目的
1．学习掌握四大类微生物菌落形态的识别。
2．学习掌握环境微生物生理鉴定结果分析的原理与方法。 3．学习掌握微生物纯化培养接种的无菌操作技术。
二、实验内容
1．四大类微生物菌落形态识别
（1） 细菌：菌落表面光滑或粗糙，边缘整齐或不规则，奶油状。
（2） 放线菌：菌落表面呈绒状，粉状或绒毛状，有些产色素，有同心环，不易 调起。
（3） 酵母菌：菌落大而厚，湿润粘稠，易调起，多数呈乳白色，少数红色。 （4） 霉菌：菌落大而疏松，呈绒毛状、絮状或蜘网状，有色素，比细菌大数倍 到几十倍。
2．土壤中细菌、放线菌、霉菌分离的结果统计 3．生理生化鉴定结果检查 项目 E.coli B.subtilis CK 备注 糖发酵 产酸 产气 产酸 产气 石蕊牛乳 凝固 液化 凝固 液化 蛋白胨 产NH3 产H2S 产NH3 产H2S 产淀粉酶
4．菌落纯培养斜面接种
将分离到的放线菌单菌落，通过无菌操作技术移接到斜面培养基，30℃培养5-7 天。
实验八 水中总大肠菌群的测定－多管发酵法
一、实验目的
结合水净化工程中的细菌检验，掌握水环境监测中和给水水质检验中大肠杆菌群 数的测定方法，同时通过大肠杆菌群的测定，了解大肠杆菌群的生化特性。
二、原理
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群细 菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行实验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN 表示。
三、仪器
高压蒸气灭菌器；恒温培养箱；冰箱；生物显微镜；载玻片；酒精灯；镍铬丝接 种棒；培养皿（直径100mm）；试管（18×180mm）；吸管（
1、
5、10mL）；烧杯；锥形瓶；采样瓶等等。
四、培养基的制备：
1.乳糖蛋白胨培养液：将10g 蛋白胨、3g 牛肉膏、5g 乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH 为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
2.三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸 馏水外，各组分用量增加至三倍。 3.品红亚硫酸钠培养基
（1）贮备培养基的制备：于2000mL 烧杯中，先将20—30g 琼脂加到900mL 蒸 馏水中，加热溶解，然后加入3.5g 磷酸氢二钾及10g 蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH 至7.2—7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g 乳糖，混匀，定量分装于250 或500mL 锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
（2）平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培 养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液（1000mL 培养基约加20mL5%碱性品红乙醇溶液），置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠（1000mL 培养基约加5g 无水亚硫酸钠），置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再退至淡红色为止（不宜加多）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。
五、测定水源水总大肠菌群实验步骤
1、初发酵试验
于各装有5mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管），分别加入 10mL 水样；于各装有10mL 乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管），分别加入1mL 水样；再于各装有10mL 乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管），分别加入1mL1： 10 稀释的水样。共计15 管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。（2）平板分离：上述各发酵管经培养24h 后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于品红亚硫酸钠培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落。
2、平板分离
品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金 属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。取有上述特征的群落进行革兰氏染色：
①用已培养18—24h 的培养物涂片，涂层要薄。 ②将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min 后用水洗去。 ③滴加助染剂，1min 后用水洗去。 ④滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20—30s），用水洗去。 ⑤滴加复染剂，1min 后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。
3、复发酵试验
上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接 种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1—3 个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查后附表1“最可能数（MPN）表”，即求得每100mL 水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L 为报告单位，故MPN 值再乘以10，即为1L 水样中的总大肠菌群数。
例如，某水样接种10mL 的5 管均为阳性；接种1mL 的5 管中有2 管为阳性； 接种1：10 的水样1mL 的5 管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5-2-0， 得知100mL 水样中的总大肠菌群数为49 个，故1L 水样中的总大肠菌群数为 49×10=490 个。 对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1：
10、1：100、1：1000 或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。 如果接种的水样量不是10mL、1mL 和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水 样量，也可查表求得MPN 指数，再经下面公式换算成每100mL 的MPN 值。
六、思考题
1、你认为要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作?关键在哪一步?为什么?
2、大肠菌群测定利用了它的哪些生化特性？
表1 最可能数(MPN)表
（接种5 份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，不同阳性及阴 性情况下100mL 水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）
实验九
空气微生物检测（平皿落菌法）
实验目的和原理：用营养琼脂培养基培养细菌；用查氏琼脂培养基培养霉菌；用高氏淀粉琼脂培养基培养放线菌。通过实验了解空气中微生物的分布，学习习近平皿落菌法检测空气微生物。
实验器材：高压蒸汽消毒锅，恒温培养箱，超净工作台，玻璃皿，营养琼脂培养基，查氏琼脂培养基，高氏淀粉琼脂培养基。 方法与步骤： 一．培养基制备
1．营养琼脂培养基：牛肉膏1.5g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，琼脂10g，加水至500ml，加热、搅拌至琼脂溶解，调pH7.2~7.4，121℃蒸汽灭菌20分钟。
2．查氏琼脂培养基：NaNO3 1g，KCl 0.25g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.25g，FeSO4 0.005g，琼脂10g，蔗糖15g，加水500ml，加热、搅拌至琼脂溶解，115℃蒸汽灭菌20分钟。
3.高氏淀粉琼脂培养基：可溶性淀粉10g先用少量冷水调成糊状，在火上加热，然后加水及KNO30.5g，K2HPO4 0.25g NaCl 0.25g，MgSO4 0.25g，FeSO4 0.25g，琼脂10g，加热溶化，调pH7.0~ 7.2，补足水至500ml，121℃灭菌20分钟。 二.每组15个平皿灭菌将营养琼脂培养基、查氏琼脂培养基、高氏淀粉琼脂培养基，三种培养基各倒5个平板，冷凝。
2.在一定面积房间或室外，按4角和中央5点，每种培养基每点放一个平板，打开盖，室内放置10分钟，室外放置3分钟后盖盖，营养琼脂培养基在37℃培养24h，查氏和高氏培养基在28℃培养48h。
3.培养结束，观察各种微生物的菌落形态，将微生物种类、菌落数和计算结果记录于下表：
三．计算：空气微生物数(个/m3)=5个皿平均菌落数×50000÷平皿底面积（cm2）÷暴露时间（min）
四．卫生标准：我国还无统一的空气卫生标准，室内一般以500～1000/m3作为参考指标。
地点
采样时间
细菌菌落
霉菌菌落
放线菌菌落
计算结果（个/m3）
细菌数量
霉菌数量
放线菌数量
实验九 菌种保藏
一、实验目的
1.学习并掌握菌种保藏的基本原理。 2.掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。
二、实验原理
微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法
三、试剂与器材
1.材料大肠杆菌、青霉菌、放线菌
2.试剂液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰
3.器材无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿；安额管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条(0.5X1.2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱(—30℃)、超低温冰箱和液氮罐等。
四、实验内容
1.斜面保藏法 2.液体石蜡法 3.穿刺保藏法 4.砂土管保藏法
5.冷冻真空干燥保存法
五、关键步骤及注意事项
1.清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。 2.熔封安瓶时防止封闭不严。 3.液氮冻存操作应防止冻伤。
六、思考题
根据你自己的实验。谈谈1--2种菌种保藏方法的利弊?
