果胶酶的生产技术
课程：食品生物技术专业： 班级： 学号： 姓名：
完成时间：2011 年5月15日
果胶酶的生产技术
摘 要： 果胶酶是一类分解果胶质的酶的总称，它能将复杂的果胶分解为半乳糖醛酸等小分子。目前果胶酶在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域得到广泛应用。果胶酶主要来自微生物。综述了微生物果胶酶生产茵的菌种、选育、鉴定、发酵方法和发酵条件优化，酶的分离纯化、酶学性质和分子生物学方面的研究进展，并介绍了果胶酶的应用进展，最后展望了微生物果胶酶研究的广阔前景。
关键词： 微生物果胶酶果胶；果胶酶；几丁聚糖；固定化研究现状 展望
1 果胶
果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以a一1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起m．它存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)[2]相互交联，使各种细
胞组织结构坚硬，表现出固有的形态．果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，总体可分为光滑区(smooth region)和须状区(hairy region)两部分，主要由HGA、RG-I和RG-II三个结构区域构成，其中RG-II常以二聚体的形式存在．同其
它植物多糖一样，果胶也是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的，也具有一定的相对分子质量分布． 2 果胶酶
2.1 果胶酶(pectolytic enzyme or pectinase)是指能够分解果胶物质的多种酶的总称．
2.2 果胶酶的分布
许多霉菌及少量的细菌和酵母菌都可产生果胶酶，主要以曲霉和杆菌为主．新近报道的其它茵有青霉如意大利青霉(Penicillium itaticum)、扩展青霉(Penicillium expansum)以及Penicillium griseoroseumt。]等，白绢菌(Selerotium rolfsii)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、微小毛霉(IVlucorpusilus)r钉、高大毛霉(Mucor mucedo)~钉、热解糖(Cloctridiumthermosaccharolyticum)、匐枝根霉(Rhizopus stolonifer)、粗糙链孢霉(Neurospora raa)L6]嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)[7]等．由于真菌中的黑曲霉(Aspergillus niger)属于公认安全级(GRAS，General Regarded As Safe)，其代谢产物是安全的，因此目前市售的食品级果胶酶主要来源于黑曲霉，最适pH值一般在酸性范围．近年来，一些来源于细菌杆菌属的碱性果胶酶日益受到重视，．随着分子生物学技术的不断提高，也可利用基因克隆技术实现果胶酶在其它微生物宿主的表达． 3 生产果胶酶的微生物 3．1 果胶酶生产菌种
目前生产微生物果胶酶的菌种很多，来源极其广泛，包括细菌、霉菌、酵母菌和放线菌。如芽孢杆菌属
(日0c Ms) ， ，”· ，、青霉属(Penicillum)、欧文氏菌(Erwinia)、根霉属(Rhizopus)、曲霉属( 一pergillus) “\'”圳、克鲁维酵母属(Kluyveromy—ces) 。、侧孢霉属(Sporotrichum)、多子菌属(Pol—yporus) 3]、密螺旋体菌属(Treponema) ]、酵母(Saccharomyces)、刺盘孢属(Colletotrichum)、螺孢菌属Spirillospora)、假单胞菌属(Pseudomonas)、毛霉属(Mucor)、毕赤氏酵母属(Pichia)[40I4 等。 3．2 果胶酶生产茵的选育
菌株品质好坏直接关系着能否产生高质量的酶液，优秀的菌株不仅能提高酶制剂的品质、产量以及发酵原料的利用率，而且还能增加品种，缩短发酵生产周期，改进发酵和提炼工艺条件等 。李瑜等 从腐烂苹果中定向分离筛选出适合液态发酵生产聚半乳糖醛酸酶的菌株YL-9， 鉴定为扩展青霉选出一株产碱性果胶酶活力较高的菌株和一定量的Bacillus(PeniciUiumexpansum)。Li从碱性土壤中筛gibsonii S-2。Souza等 从土壤样品中筛选到一株产内切聚半乳糖酸活力较高的菌株Peacilomyces2A．UMIDA．1。Noomen等， 以野生型菌株Penicillium occitanis CLIO0为出发菌株，经亚硝酸诱变育种后得到一株产果胶酶较高的突变株Peni—cillium occitanis Po16，其果胶酶活力高达原始菌株的50倍。诸葛斌等 对基因工程育种得到的产碱性果胶酯裂解酶(PL)的基因工程菌Pichia pastoris进行了研究，使碱性果胶酯裂解酶(PL)表达量达到一定量 3．3 果胶酶生产菌的鉴定
目前，果胶酶生产菌多采用经典法和分子生物学方法相结合对新分离菌株进行鉴定。 基于形态学与ITS序列分子系统进化分析，将新分离的高产果胶酶菌株EIM一6鉴定为AspergiUusniger。Li等 结合经典方法和分子生物学方法将株新分离的产碱性果胶酶活力较高的菌株S-2鉴定为Bacillus gibsonii。柯崇榕等 基于18S rDNA序列的系统发育进化分析将果胶酶高产菌EIM．4鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。 4 微生物果胶酶的发酵 4．1 发酵方法
目前，微生物果胶酶的发酵方法主要有3种方法，包括液态发酵法、固态发酵法和固定化细胞法。
4．1．1 液态发酵法Tari等 采用Aspergillus SO—he ATCC 20235经液态发酵生产聚半乳糖醛酸酶。Sharma等 采用Bacillus pumilus dcsrl经液态发酵生产高碱性和热稳定性的果胶酶。Patil等 以葵
花盘作为基质，分别接种Aspergillus niger DMF 27和Aspergillus niger DMF 45进行液态发酵和固态发酵生产果胶酶。
4．1．2 固态发酵法Botella等 采用葡萄皮渣为基质，接种一定数量Aspergillus awamori 2B．361 U2／1经固态发酵生产外切聚半乳糖醛酸酶。Jing等 采用 一pergillus niger经固态发酵生产果胶酶。Silva等以农产品加工废弃物柑橘皮渣和麸皮为基质，采用菌种Penicillium viridicatum RFC3经固态发酵生产 果胶酶。
4．1．3 固定化细胞法 Almeida等 研究显示带循环流动填充床生物反应器更适合固定化Kluyvero—myces marxianus CCT 3172细胞生产果胶酶。Almei—da等 研究表明在带循环流动填充床生物反应器中，多空玻璃载体和纤维素载体均适合固定化Kluyveromyces marxianus CCT 3 1 72细胞生产果胶酶。 4．2 发酵条件优化
发酵是菌种产生代谢产物的主要环节，除菌种固有的遗传因素外，发酵条件是影响产酶的重要因素。Patil等 以葵花盘作为基质，分别接种Asper—gillus niger DMF 27和DMF 45进行液态和固态发酶，结果表明液态和固态发酵的适宜温度和pH均分别为34~C和pH5．0，最佳接种量分别为1×10 g／mL和1 X 10 g／mL，最大产酶率分别为12．6 U内切果胶酶／g和34．2 U外切果胶酶／g。Cavalitto等采用响应面分析对Geotrichum klebahnii ATCC42397产原果胶酶的发酵条件进行了优化，结果显示pH和Fe“对原果胶酶产率有显著影响，在较优条件下原果胶酶产率达到236 U／mL。 5 微生物果胶酶的分离纯化
国内外学者对微生物果胶酶的分离纯化进行了研究，常采用的分离纯化和鉴定方法有超滤、硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等点聚焦等。Yadav等 采用硫
酸铵沉淀、DEAE．纤维素和G．100凝胶过滤层析对Aspergillusflavu,MTCC 7589所产碱性果胶裂解酶进行了分离纯化，经SDS-PAGE显示为单一条带；纯化酶的最适温度和pH分别为50℃ 和8．0，Km和kcat值分别为0．59 mg／mL和52．2 S～，酶的分子量为38±01 kD，具有良好的脱胶能力。Sehnitzhofer从Sclerotium rolfsii CBS 350．80所产聚半乳糖醛酸酶粗酶液中经等点聚焦制备电泳得到两个聚半乳糖醛酸酶分别为PG1和PG2，它们的分子量和等电点分别为39．5 kD和pI 6．5与38 kD和pI 5．4，它们性质非常相似，都是内切聚半乳糖醛酸酶。Pichia Pastoris中实现了Bacillus subtil~XZ2产原果胶酶基因的真核表达。Gonza lez等 ¨研究了61株Saccharomyces cerevisiae产酒菌株中的聚半乳糖醛酸酶活性，寻找其中含有表达内切聚半乳糖醛酸酶的基因(PGU1)并研究其表达的聚半乳糖醛酸酶活性，从中筛选出菌株S．cerevisiae UCLMS．39，并对其表达内切聚半乳糖醛酸酶的基因(PGU1)进行了克隆测序。Walker等 对菌株Treponema pectinovo．rum ATCC 33768中编码果胶盐裂解酶的基因pelA进行了克隆和表达，重组酶蛋白的性质与其他细菌果胶盐裂解酶有相似之处，它们的最适作用pH均为碱性范围，酶活对钙离子有依赖性 6 微生物果胶酶的性质
国内外学者对微生物果胶酶的性质进行了研究，为果胶酶的深入研究和应用奠定了基础。Ce—lestino等 纯化了Acrophialophora nainiana所产胞外果胶酶，纯化酶经SDS．PAGE和质谱得到分子量分别为35．5 kD和30．749 kD，最适温度和pH分别为60℃ 和8．0，Km值为4．22 mg／mL，能被L一色氨酸、DEPC、DTT、DTNB、DTP、L．半胱氨酸、B-巯基乙醇激活，却被NBS、Fe“、Cu“、Zn“、Mn“、A1“、Ca“抑制，其N端氨基酸序列分别与来自Bacilluslicheniformis和Xanthomonas campestris的果胶盐裂解酶有66和68％的相似性。Lei等 研究发现固定化果胶酶和未固定化酶的最适温度和pH相同，分别均为65℃和6．0。 7 展望
随着经济的发展，人们生活水平的提高，健康、环境、资源和能源越来越受到人们的重视，现代分子生物学和酶工程在现代生活中的作用越来越突出。微生物是果胶酶的重要来源。微生物果胶酶种类繁多、来源广泛、结构复杂、性能各异、生产条件和作用方式多样、分离纯化手段灵活多变、应用领域十分广泛、发展前景极为广阔。近年来国内外许多学者对果胶酶生产菌株的筛选、育种、鉴定、发酵、酶的分离纯化与酶学性质以及酶的分子生物学特性与应用等方面进行了大量的研究，这极大地促进了果胶酶的深入研究及其在包括食品和纺织工业在内的许多领域的广泛应用，从而使资源得到循环利用，有利于环境保护、人体健康和减缓能源危机，具有极大的经济和社会效益。以后有关果胶酶分子生物学和酶工程的研究将成为热点，通过蛋白质工程技术和定点突变使果胶酶在不同的研究和应用环境中保持良好的活性和稳定性，以满足研究和应用的实际需要。将来在分子水平上果胶酶分泌的调节机制以及不同果胶酶作用于不同果胶物质的作用机理将成为果胶酶研究的重要方向
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