16sRNA PCR 扩增及凝胶电泳分析
微生物学20092474王紫枫
一、实验目的
1．熟悉细菌活化及培养过程
2．掌握PCR扩增技术及方法
3．掌握凝胶电泳分析技术
二、实验原理
rRNA进化缓慢，具有高度保守性。不同微生物的rRNA的基因序列在某些位点以不同的几率发生突变。同时，小核糖体亚基16sRNA分子量大，携带信息量大，可作为属种鉴定的基础。
通过筛选的细菌，做活化培养后，细菌在缓冲液酶解，通过细胞破壁、裂解、离心得到RNA相关序列，在经过设定PCR相关条件。温度、循环次数，将裂解液加入到体系中进行扩增。在完成循环后进行凝胶电泳、拍照、序列分析。
三、实验用品
供试菌种53种、编号试管每株两个LB固体和液体培养基、Mg2+、无菌水、EB Buffer、TE离心管、移液枪
四、实验步骤
1．将供试菌株编号，没人分得3个菌株。
2．将菌株接入固体培养基进行活化，培养24小时。
3．将活化后的菌株挑一环，接入5ml液体培养基内振荡培养16小时得到菌悬液。
4．取1.5ml菌悬液于离心管，10000转5分钟弃上清。
5．用无菌水洗涤一次，沉淀悬浮于150ul TE Bufler。
6．将上述悬液在沸水上煮10分钟，水浴10分钟，10000转5分钟离心后，上清液于-20℃保存。
7．取上述上清液1ul于PCR中。
8．3小时PCR扩增。
9．将扩增后的序列取1ul于EB，并注入电泳槽中。
10． 经过电泳后的凝胶，取出于紫外荧光灯中显色，拍照并分析。
五、实验结果
经过拍照，仅有
2、
3、
6、
9、
22、
38、
39、40号扩增出了新的序列显色明显。其他没有扩增出来的原因可能是提取过程中丢失。另外第三块胶板没有明显变化的主要原因可能是电泳时入缓冲液使用了旧的缓冲液，并未出现预期的结果。
六、注意事项
1．预制固体培养基琼脂要加够量，否则很难凝固。
2．在转接时，挑取的一环尽量多一些，肉眼可看见的状态为宜，生长期长一些。
3．缓冲液先用现配。
