现代仪器分析模块
二、三复习提纲
1、液相色谱依分离机制分类时可有哪些主要类型？各类色谱法的固定相分别是什么？各适于分离那些组份？
答：液相色谱依分离机制分类可分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱。
吸附色谱法基本原理：利用吸附剂对样品中各组分吸附能力的不同，在两相作相对运动时，导致各组分在色谱柱中产生差速迁移，使保留时间不同而分离。其固定相为吸附剂。适于分离极性不同的化合物，也能分离相同极性基团，但数量不同的样品，还适于分离异构体。
分配色谱法又称液液柱色谱法，其基本原理是利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离的。固定相：又称固定液，应是样品的良好溶剂，不溶或难溶于流动相。液液色谱是基于化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对质量不同而达到分离的，既能分离极性化合物，也能分离非极性化合物。
离子交换树脂原理：它是利用离子交换树脂上可交换离子与流动相中的组分离子的交换能力不同而获得分离。其固定相是离子交换树脂。适用于分离离子型化合物。
空间排阻色谱空间排阻色谱是基于试样分子的尺寸和形状的不同而实现分离的。固定相是凝胶。它是测定高分子化合物分子量的可靠方法，广泛应用于生物材料高分子化合物的分离及生物制剂的纯化等。
2、何为正相分配色谱和反相分配色谱？各适于分离哪些组份？
答：正相色谱法又称常规色谱法：用极性溶剂作固定液，用非极性或弱极性溶剂作流动相。 反相色谱法用非极性或弱极性溶剂作固定相，极性溶剂作流动相。
正相色谱法 反相色谱法
固定相极性 大 小 流动相极性 小 大 组分分离 极性小的先流出 极性大的先流出 适用分离对象 极性化合物 非极性或弱极性化合物
3、气相色谱仪由哪几个部分组成？各有什么作用？
答：气相色谱仪按功能其结构可分为五大部分：（1）气路系统，包括载气气源、气体调节与控制（减压阀、稳压阀、稳流阀、流量计及压力表）；（2）进样系统，包括气体进样阀、进样器及控温部件；（3）分离系统，包括色谱柱、柱室及控温部件；（4）检测系统，包括检测器及控温部件；（5）记录系统，包括放大器、记录仪及数据处理机。 仪器工作时，由钢瓶或气体发生器提供载气，经减压阀减压，经净化器脱水及净化，稳压阀稳压，稳流阀稳定气流，经转子流量计测定其流速后，以稳定的压力、恒定的流速连续流过气化室，色谱柱，捡测器，最后放空。载气将各分离组分依次带入检测器将各组分浓度（或质量）的变化转变为电压（或电流）变化，并由记录器记录。由于电讯号强度正比于物质浓度，经放大器放大后送入数据处理机记录流出曲线，并做出相应的峰处理。
4、用哪些参数去描述一个组分的色谱峰？这些参数各有何意义？
色谱图（chromatogram） 由流出物通过检测系统所产生的响应信号对时间（或载气的流出体积）作图，所绘制的曲线图，即为色谱图。图中突出部分称为色谱峰。样品中各组分被色谱柱分离完全时，图中每一个色谱峰代表一个组分。色谱峰可用三项参数：峰位（用tR表示，用于定性）、峰高或峰面积（用于定量）、区域宽度（用标准偏差、半高峰宽、峰宽表示，用于衡量柱效）说明。
1) 基线（baseline）：反映仪器（主要是检测器）的噪音随时间的变化。 2) 保留值
（1） 死时间：不被固定相滞留的组分从进样到出现峰最大值所需的时间，此时K=0。 （2） 保留时间 保留体积VR＝t R·Fc（ Fc为载气流速） （3） 调整保留时间
（4） 相对保留值：它表示色谱柱（固定相）对不同组分的选择性。 3) 峰面积与峰高
峰面积（peak area）用A表示，指色谱峰所包括的面积 峰高（peak height）用h表示，指从峰最大值到峰底的距离 一定操作条件下，A、h 组分的量
4) 区域宽度：常用于评价柱效。
（1） 峰宽（peak width）,用W表示，在峰两侧拐点处作切线与峰底相交两点间的距离。 （2） 半高峰宽（peak width at half height）：用Wh/2表示，指峰高一半处的峰宽。测定时通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离即为Wh/2。
（3） 标准偏差： W0.607h=2
5、用范氏方程式讨论气相色谱实验条件的选择：（1）载气流速与载气分子量；（2）柱温；（3）载体粒度、粒度分布、形状及柱填充均匀程度；（4）固定液涂层厚度。
答：Van Deemter从动力学理论研究了使色谱峰扩张而影响塔板高度的因素，提出了Van Deemter方程式 H=A+B/+C
a) 涡流扩散项A：A＝2dp ，式中为填充柱的填充不规则因子；dp为载体的平均颗粒直径（粒度）。色谱柱填充越规则、均匀，载体平均颗粒直径越小，涡流扩散越小，色谱峰扩张变形越小。
b) 分子扩散（纵向扩散）项B：B＝2γDg，式中γ为路经弯曲因子；Dg为组分在气相中的扩散系数。γ与填充物有关，它表明溶质在载气中的扩散因色谱柱中填充物的存在而受到的阻碍。只有限制组分自由扩散，使扩散距离尽可能降低，γ才会较小（一般填充柱γ
C）传质阻力项C：Cu＝（CL＋Cg）u：减小固定液液膜厚度，增大组分在液相中扩散系数，在较小的载气流速下操作，液相传质阻力较小。减小填充柱中载体的平均粒度，增大组分在气相中扩散系数及在较小载气流速下操作，气相传质阻力较小。在气相、液相传质阻力都小时，总的传质阻力小，色谱峰变形扩张小。
固定液用量较大时，液膜较厚，液相传质阻力成为主要影响因素。而固定液用量低时，气相传质阻力则成为主要因素。现代气相色谱分析一般采用低固定液用量以加快分析时间，因此主要应考虑气相传质阻力。
6、何为分离度？哪些因素影响分离度？如何影响？是否分离度越大越好？
答：分离度R 又称分辨率，用于表示相邻两色谱峰分离程度的指标，以两组份保留值之差与平均峰宽值之比表示。R＝
(tR2tR1)2(tR2tR1)＝
(W1+W2)/2(W1+W2)式中tR1,tR2分别为组分
1、组分2的保留时间；W
1、W2分别为组分1和组分2色谱峰峰宽。 分离度与柱效能、柱选择性及柱容量的关系 推导可得：
上式表明：提高柱效能，即增加理论塔板数，可增加分离度；在不增加柱长前提下，设法降低板高是增加分离度的有效途径；增加柱选择性，即增大相对保留值可极大地改善分离度；加大柱容量，即使容量因子加大，则色谱柱分离度也增大。但应注意增大容量因子会使分析时间延长，引起色谱峰扩张变形。
实际计算分离度时应以分析样品中最难分离物质对或相对两组份的色谱峰作为计算依据。分离度不是越大越好，只要满足分离要求就可以。
7、进样器、色谱柱、检测器的温度各如何确定？柱温过高过低的结果是什么？
答：气化室温度即进样器的温度，取决于样品的挥发性、沸点及进样量。可等于样品的沸点或稍高于样品的沸点，以保证完全气化。但一般不超过沸点50℃以上，以防样品分解。
检测器温度：为了使色谱流出物不在检测器冷凝，而污染检测器。检测器温度需高于柱温，一般高30到50℃，或等于气化室温度。但若检测器温度太高，热导检测器的灵敏度降低。
柱温不能高于固定液的最高使用温度，否则会造成固定液大量挥发流失。但柱温不能太低，否则液相传质阻力增加，导致色谱峰拖尾。
8、何为载体？有几种类型，如何选用？
答：载体是固定液的支持骨架，使固定液能在其表面上形成一层薄而匀的液膜。载体可以分成两类：硅藻土类和非硅藻土类。
硅藻土类载体是天然硅藻土经煅烧等处理后而获得的具有一定粒度的多孔性颗粒。按其制造方法的不同，可分为红色载体和白色载体两种。
红色载体因含少量氧化铁颗粒而呈红色。其机械强度大，孔径小，比表面积大，表面吸附性较强，有一定的催化活性，适用于涂渍高含量固定液，分离非极性化合物。
白色载体是天然硅藻土在煅烧时加入少量碳酸钠之类的助熔剂，使氧化铁转化为白色的铁硅酸钠。白色载体的比表面积小，孔径大，催化活性小，适用于涂渍低含量固定液，分离极性化合物。
9、气相色谱有几种定量方法？各有何特点及适用范围？ 答：气相色谱定量方法有归一化法、外标法及内标法。
（1） 归一法：指根据组分含量与峰面积成正比，对于混合物中组分i的百分含量等于它的色谱峰面积在总峰面积的百分比。计算公式为：Xi（％）＝100fiAi/(fiAi)
i1n式中Xi为试样中组分的百分含量，fi为组分i的校正因子，Ai为组分i的峰面积。 优点：操作简便，操作条件变化时分析结果影响较小；定量分析结果与进样量无关（必须以不超载为前提）。
缺点：所有组分在一个分析周期都能流出色谱柱，且检测器对所有组分都要有所响应。 （2） 外标法：指在相同的操作条件下，分别将等量的试样和含待测组分的标准品进行色谱分析，比较试样与标准品中待测组分的峰值，求出待测组分的含量的方法。计算公式为：Xi＝EiAi／AE 式中Xi为试样中组分i的含量，Ei为标准试样中组分i的含量，Ai为试样中组分i的峰面积，AE为标准试样中组分i的峰面积。
优点：操作简便且不必求校正因子；在线性范围内，待测组分在试样、标准试样中含量相近时，定量分析准确度较高。
缺点：对进样操作重现性、仪器稳定性要求较高，同时在实际应用时应定时校正线性。 该法要求进样量准确且实验条件恒定。为降低实验误差，应尽量使配制的标准溶液浓度与样品中i组分浓度相近，且进样体积最好相等。
（3） 内标法：指在已知量试样中加入能与所有组分完全分离的已知量内标物，用相应校正因子校准待测组分的峰值并与内标物质的峰值进行比较，求出待测组分百分含量的方法。计算公式如下：Xi（％）＝100msAifis/mAs
式中Xi为试样中组分i的百分含量，m为试样的质量（g），ms为加入内标物质的质量（g），Ai为组分i的峰面积，As为内标物质的峰面积，fis为组分i对内标物质的相对校正因子。 适用范围：对在一个分析周期内混合物样品中所有组分不能全部流出色谱柱；或检测器不能对所有组分都响应；或只需测定混合物中某几个组份含量时，可用内标法。 内标法的优点：
①在进样量不超过限定量的前提下，结果与进样的重复性无关 ②只要被测组分与内标物出峰，且分离度符合要求就可定量
③适合分离药物中的微量组分。有时微量组分与主要成分的含量相差悬殊。 缺点：必须准确计量样品和内标物的量，且有时不易找到合适的内标物。
10、高效液相色谱仪由哪些部件组成？与气相色谱仪比较有何异同？
答：高效液相色谱仪一般由五个部分组成：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。输液泵、色谱柱、检测器是仪器的基础部件。 GC
HPLC
分析对象
在操作温度下能迅速气化且不
分解
可分析20 %的有机物
能制成溶液即可，不需气化（高分子和
离子型）
可分析80 %的有机物
应用范围
流动相 选择余地小，一般不影响分离
选择范围宽，明显影响分离（极性和pH
不易
不高
值） 容易，可用于制备
较高,更为安全 柱后回收
价格及安全
11、正相色谱中常用的固定相和流动相有哪些？适合分离哪些类型化合物？
答：在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-C N）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。
12、反相色谱中常用的固定相和流动相有哪些？适合分离哪些类化合物？
在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称O D S或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。
反相键合相色谱是应用最广泛的色谱法，适合分离非极性至中等极性的组分。
13、高效液相色谱中常用的洗脱方式有哪些？
答： 洗脱方式有恒组成溶剂洗脱和梯度洗脱。恒组成溶剂洗脱是用恒定配比的溶剂系统洗脱。梯度洗脱是将两种以上不同性质但可以互溶的溶剂，按一定程序在分离过程连续或间断改变这些溶剂的组成比例，以改变流动相极性、离子强度的PH值等，使得被测组分相对保留值发生改变，达到改善分离效能，加快分析速度，缩短分析时间，提高灵敏度的目的。用来分析复杂试样中性质差异较大的组分。
14、离子源有什么作用？常用的离子源有哪些？各有何特点？
答：离子源的作用是使待分析的物质电离成离子，并将离子汇聚成有一定能量和一定几何形状的离子束 常用的离子源有：
（1） 电子电离源：优、缺点：离子产率高，稳定性好；但对于不稳定的有机化合物，往往会使绝大多数分子都生成碎片离子，得到不易辨认的分子离子峰。 （2） 化学电离源：一般有较强的[M+H]+ 或[M-H]+准分子离子峰，还可得到[M+ 17]+和[M+ 29]+的正离子，而碎片离子峰较少，质谱图大为简化，容易解析。
（3） 电喷雾电离源：适合于分析极性强的大分子有机化合物，容易形成多电荷离子 （4） 基质辅助激光解吸离子源：准分子离子峰很强，且碎片离子少。通常用于飞行时间质谱，组成MALDI-TOF，特别适合测定多肽、蛋白质、DNA片段、多糖等的相对分子质量。
15、什么是氮数规则：相对分子质量为偶数的化合物，必含有偶数个氮原子或不含有氮原子；相对分子质量为奇数的化合物，只能含有奇数个氮原子。
16、简述质谱仪的主要部件及其作用
答：（1）真空系统，质谱仪的离子源、质量分析器、检测器必须处于高真空状态。 （2）进样系统，将样品气化为蒸气送入质谱仪离子源中。样品在进样系统中被适当加热后转化为即转化为气体。
（3）离子源，被分析的气体或蒸气进入离子源后通过电子轰击（电子轰击离子源）、化学电离（化学电离源）、场致电离（场致电离源）、场解析电离（场解吸电离源）或快离子轰击电离（快离子轰击电离源）等转化为碎片离子。
（4）质量分析器，自离子源产生的离子束在加速电极电场作用下被加速获得一定的动能，再进入垂直于离子运动方向的均匀磁场中，由于受到磁场力的作用而改变运动方向作圆周运动，使不同质荷比的离子顺序到达检测器产生检测信号而得到质谱图。 （5）离子检测器，通常以电子倍增管检测离子流。
17、理论塔板数的计算
18、内标、外标、归一化法的计算方法
19、何谓指示电极和参比电极？各包括哪些常用的电极？
答：指示电极——电极电位值随溶液中待测离子活度的变化而变化的电极。 参比电极——电极电位值不随溶液中待测离子活度的变化而变化的电极。 常用的指示电极有：玻璃膜电极、离子选择电极等。 常用的参比电极有：饱和甘汞电极、银/氯化银电极等。 20、质谱检测原理及质谱分类
答：质谱法是通过对待测样品离子的质荷比(m/z)的测定来进行分析的一种分析方法。质谱仪器按其用途可分为无机质谱仪、有机质谱仪和同位素质谱仪。质谱仪器按其研究对象可分为原子质谱仪和分子质谱仪。
